Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em> Кишечная палочка</em>: Проектирование, производство и очистка

Представленный здесь метод для проектирования, производства и очистки ферментных загруженным бактериальных везикул наружной мембраны (OMV). OMV невелики, в первую очередь однослойными, протеолипосомы , которые варьируются в размерах от 30-200 нм ^1,2. Все грамотрицательных и грамположительных бактерий , которые были изучены на сегодняшний день продемонстрировали выпуск либо OMV или внеклеточного везикул (EV) с их поверхности ^3,4. Точный механизм, с помощью которого производится OMV, еще не выяснена из-за разнообразных популяций бактерий, которые секретируют их, а также различные функции, которые они обслуживают. OMV было показано для транспортировки широкого спектра грузов из малых молекул, пептидов и белков генетического материала , где подают разнообразные сложные сигнализации, транслокации генов и вирулентности функции ^5,6.

Точные механизмы OMV биогенезе не хорошо охарактеризованы, и, по всей видимости различаются между видами бактерий. Несмотря на Тхиs факт, мы разработали метод для повышения эффективности упаковки рекомбинантного белка в OMV, создавая искусственную связь между интересующим белком и весьма распространенный белок эндогенными по отношению к бактериальной внешней мембране и последующей OMV. При отсутствии синтетического связывания, или искусственно включенной сродства между рекомбинантно экспрессировать белок и OMV наблюдаемая эффективность упаковки очень низкая ^7. Этот результат следует ожидать, как включение белков внутри OMV либо происходит через случайный шанс инкапсуляцией именно в тот момент формирования OMV на бактериальной поверхности, или с помощью направленной упаковки с помощью механизмов, недостаточно хорошо изучены. Некоторые успехи были отмечены в упаковки белки просто через более чем выражение в периплазматическое пространство, которое опирается на случайный шанс инкапсуляция, но эффективной упаковки очень белков зависит с некоторыми белками упаковка на высокую эффективность по сравнению с другими мна не пакет вообще ^8-10. Используя общие методы синтетической биологии мы стремились инженер кишечной палочки (E.coli) , чтобы одновременно производить, упаковки и секретировать активный интерес фермент в OMV , который обходит существующие ограничения знаний относительно того, как формируются OMV и как груз выбирается для бактерий упаковка.

Для целей настоящего приложения сплит-системы белка биоконъюгации была выбрана в качестве синтетического увязка выбора для облегчения направленного упаковки в OMV. Как следует из названия сплит-системы белка биоконъюгации состоит из двух дополняющих друг друга областей субъединиц, которые взаимодействуют друг с другом. Раскол белковые домены , выбранные для целей настоящего протокола упоминаются как SpyCatcher (SC) и SpyTag (ST) области и являются производными от Streptococcus Пирролидонилпептидаза фибронектин-связывающего белка (FbaB) ^11. Эта система сплит белок является необычным в том, что WКурица двух субъединиц находятся в пределах досягаемости isopeptide связь спонтанно образует между проксимальным аспарагиновой кислоты и лизина аминокислотных остатков, создающих ковалентной связи. Формирование Isopeptide связь не требует добавления белков – шаперонов, каталитические ферменты или кофакторов , и может легко происходить при комнатной температуре (RT) и в широком диапазоне физиологически соответствующих условий ^12.

Как доказательство концепции, была выбрана phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) от Brevundimonas diminuta быть упакованы в E.coli , полученный OMV ^13. PTE содержит двухъядерный активный сайт Zn / Zn и обладает способностью расщеплять органофосфаты посредством реакции гидролиза конвертерной aryldialkylphosphates в dialkylphosphates и арильных спиртов ^14. Воздействие органофосфатам ослабляет надлежащую функцию медиатора через ингибирования гидролиза ацетилхолина ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечных синапсах Макинг фосфорорганические соединения , полученные чрезвычайно опасные ^15. Длительное или значительное воздействие органофосфатам обычно приводит к неконтролируемым судорогам и обычно приводит к смерти через асфиксию. В то время как ПТЭ демонстрирует самую высокую каталитическую активность по отношению к параоксон, очень мощный инсектицид, он также способен гидролизовать широкий спектр других пестицидов и V / тип G химические нервно – паралитических веществ ^16. Для облегчения OMV упаковки, бактериальной плазмиды была разработана, который кодирует ген конструкцию, содержащую индуцируемый промотор, периплазматического последовательность локализации и короткий сайт множественного клонирования выше последовательности гена СК. Введение гена PTE между лидерной последовательностью и последовательностью SC позволило для создания генетического переключателя, мишенью которого слитый белок ПТЭ-SC в периплазматическое пространство для OMV упаковки. Хотя усилия, описанные здесь, сосредоточены на ПТЭ, ген фермента является взаимозаменяемым и может быть легко заменена другой последовательностью гена к FACilitate упаковка альтернативного фермента или белка.

В качестве второй части синтетической связи, обильное белок наружной мембраны (OmpA) выбирают так, чтобы представить пептидную последовательность ST. В то время как выбор анкерной белка может варьироваться, важно, что белок имеет разрешающий домен, который представляет в периплазматическом пространстве, переносит слитой конструкции без индукции цитотоксичности, как известно, присутствует в OMV, и не агрегирует, когда она является рекомбинантным производится. OmpA является 37,2 кДа трансмембранный порин белок , который , как известно, высоко выражена в бактериальной внешней мембране и последующего OMV ^17. Он участвует в транспорте малых молекул, <2 нм в размере, по всей бактериальной мембраны ^18. Родной OmpA имеет два структурно уникальные домены, трансмембранный бета ствол мотив и periplasmically растворимый С-концевой части , как известно, взаимодействуют с пептидогликана ^19. В мутантного OmpA-ST слитого Designed здесь С-концевую часть OmpA был удален, а ST был слит с periplasmically обращенной N- или С-концами. Удаление периплазматическому часть OmpA уменьшает количество взаимодействий между наружной мембраной и пептидогликана , что приводит к дестабилизации мембраны , приводящей к гипер- везикуляцией ^7. Геномные OmpA поддерживалось в дополнение к рекомбинантно экспрессировать OmpA-ST конструкции для смягчения грубой мембранной дестабилизацию.