Summary

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em>エシェリヒア・コリ</em>:デザイン、生産および精製

Published: November 16, 2016
doi:

Summary

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Abstract

外膜小胞(OMV)をプログラムするために、合成生物学の技術を適用する際の関心の高まりは、従来のナノ粒子が合成することが非常に困難証明しているOMVのためのいくつかの非常に興味深く、ユニークなアプリケーションにつながっています。現在までに、すべてのグラム陰性菌には、小分子、ペプチド、タンパク質および遺伝物質を含む貨物の種々のOMV実証パッケージを生成することが示されています。それらの多様な貨物に基づいて、OMVは、細胞間コミュニケーションの遺伝子導入及び細菌がOMVを生成しているに応じて病原性因子の送達に至るまで多くの生物学的プロセスに関与しています。ごく最近になって、細菌のOMVは制御し、OMVへの組換えタンパク質の直接包装するための技術の開発を通じてアプリケーションの広い範囲にわたって使用するためにアクセス可能となっています。このプロトコルは、生産、精製する方法を記載し、そして酵素の使用を向上Overaのために提供するOMVをパッケージ化組換え酵素、小胞形成の増加、及び強化酵素安定性のLL製造。このプロトコルの成功利用は同時に、組換えタンパク質を産生する組換えタンパク質および外膜アンカータンパク質との間に合成リンケージを作成を通じてOMVのカプセル化のためにそれを指示する細菌株の作成になります。医薬品送達、医療診断、および環境修復:このプロトコルはまた、などの他のユニークなアプリケーションのための使用のためにこのプロトコルを適応する際に考慮すべき細菌培養と同様に適切な取り扱い技術や物事からOMVを単離するための方法を詳しく説明します。

Introduction

ここで紹介するには、設計、生産、および酵素ロード細菌の外膜小胞(OMV)の精製方法です。 OMVは、30から200 nmの1,2からサイズの範囲でプロテオ主に単層、小さいです。現在までに研究されているすべてのグラム陰性及びグラム陽性菌は、その表面3,4からOMVまたは細胞外小胞(EV)のいずれかの放出を示しました。 OMVが生成されることにより、正確なメカニズムは完全に起因する彼らだけでなく、彼らが仕える様々な機能を分泌し、多様な細菌集団に解明されていません。 OMVは、複雑なシグナル伝達、遺伝子転座の様々なサービスを提供する遺伝物質を小分子、ペプチド、及びタンパク質から貨物の広い範囲を輸送することが示されており、毒性は5,6機能します。

OMVの生合成の正確なメカニズムは十分に特徴付けられ、そして細菌種間で異なるように思われていません。 THIにもかかわらず、事実は、我々は、目的のタンパク質と細菌の外膜に非常に豊富なタンパク質の内因性およびその後のOMVの間の合成結合を作成することによりOMVへの組換えタンパク質のパッケージング効率を高めるための方法を開発しました。合成結合、または人工的に組み込まれた親和性の非存在下で、組換えにより発現されたタンパク質およびOMVの間に観測されたパッケージング効率は7非常に低いです。この結果は、どちらかがよく理解されていないメカニズムによって細菌表面にまたは指向包装を通してOMV形成の正確な瞬間に偶然カプセル化を介して起こるOMV内のタンパク質の取り込みとして期待されます。第他人と比較して高い効率でパッケージング、いくつかのタンパク質との依存性タンパク質は非常にいくつかの成功は偶然のカプセル化が、効果的なパッケージに依存してペリプラズム空間内で過剰発現は、単にを通じてパッケージングタンパク質で観察されているですまったく8-10でパッケージ化しないでください。我々は同時に、パッケージを生成し、OMVが形成されている方法と貨物がために細菌によって選択される方法に関する現在の知識の限界を回避するOMVに関心の活性酵素を分泌する大腸菌 (E. coli)を操作するために求められる一般的な合成生物学の技術を利用することによって包装。

本出願の目的のためにスプリットタンパク質バイオコンジュゲーションシステムは、OMVに指向性パッケージングを容易にするために選択した合成結合として選択しました。名前が示すように、分割のタンパク質バイオコンジュゲーションシステムは、互いに相互作用する二つの相補的なサブドメインで構成されています。このプロトコルの目的のために選択された分割されたタンパク質ドメインはSpyCatcher(SC)とSpyTag(ST)ドメインと呼ばれ、 化膿連鎖球菌のフィブロネクチン結合タンパク質(FbaB)11から誘導されます。この分割されたタンパク質系は、ワットに珍しいです鶏は、2つのサブユニットが近接範囲内であるイソペプチド結合は、自然に共有結合を作成酸およびリジンのアミノ酸残基アスパラギン近位の間に形成されます。イソペプチド結合の形成は、シャペロンタンパク質、触媒酵素、または補因子の添加を必要とせず、容易に室温(RT)で、かつ生理学的に関連する条件12の広い範囲にわたって起こり得ます。

コンセプトの証明としては、Brevundimonasのディミニュータからホスホトリエステラーゼ(PTE)(EC 3.1.8.1)は、OMV 13由来の大腸菌にパッケージ化されるように選択されました。 PTEは、二核のZn / Znの活性部位を含み、ジアルキルホスフェートおよびアリールアルコール14にaryldialkylphosphatesを変換する加水分解反応を通じて有機リン酸塩を打破する能力を有しています。有機リンへの曝露は、神経筋接合部のmakinでアセチルコリンエステラーゼによってアセチルコリンの加水分解を阻害することにより、適切な神経伝達物質の機能を損ないます15非常に危険グラムの有機リン由来の化合物。有機リン酸エステルへの長期的または重大なエクスポージャーは、一般的に制御不能な痙攣をもたらし、一般的に窒息を介して死を引き起こします。 PTEは、パラオキソンに向かって最も高い触媒活性を示すが、非常に強力な殺虫剤は、また、他の殺虫剤とV / G型化学神経剤16の広い範囲を加水分解することが可能です。 OMVのパッケージングを容易にするために、細菌プラスミド、誘導性プロモーターを含む遺伝子構築物、ペリプラズム局在化配列、およびSC遺伝子配列の上流の短い多重クローニング部位をコードするように設計しました。 OMV包装用ペリプラズム空間にPTE-SC融合タンパク質を標的に遺伝スイッチの作成を許可されたリーダーとSC配列との間のPTE遺伝子の挿入。ここで説明する努力がPTEに焦点を当てながら、酵素遺伝子が交換可能であると容易にFACに別の遺伝子配列で置換することができ代替酵素またはタンパク質のilitate包装。

合成結合の第二の部分として、豊富な外膜タンパク質(のOmpA)は、STペプチド配列を提示するように選択されます。アンカータンパク質の選択を変えることができるが、タンパク質がペリプラズム空間に提示許容ドメインを有し、細胞毒性を誘発することなく融合構築を許容することが不可欠である、OMV中に存在することが知られており、それは、組換えとき凝集していません生産。 OmpAは非常に細菌の外膜およびその後のOMV 17内で発現することが知られている37.2 kDaの膜貫通ポリンタンパク質です。これは、大きさが2nmで細菌膜18を横切って、<、小分子の輸送に関与しています。ネイティブのOmpAは、2つの構造のユニークなドメイン、膜貫通βバレルモチーフとペプチドグリカン19と相互作用することが知られペリプラズム可溶性C末端部分を有しています。変異型のOmpA-ST融合デザイン性でDここでのOmpAのC末端部分は削除されたとSTは、ペリプラズムに面しN末端またはC末端に融合させました。 OmpAのペリプラズム部分を削除すると、外膜と超小胞7につながる膜不安定化をもたらしペプチドグリカンとの間の相互作用の数を減少させます。ゲノムのOmpAは、総膜不安定化を緩和するために、組換え的に発現のOmpA-ST構築に加えて維持しました。

Protocol

プラスミドの調製双直交リンケージドメインに融合アンカータンパク質(のOmpA)(アンカー-STとしてこのプロトコルで呼ばれる)、(そのような精製および同定のための6xHis、MYCまたはFLAGタグなど)エピトープタグを含むプラスミド( 例えば、pET22)を準備し、選択された細菌株7に基づいて複製のペリプラズム局在タグ、抗生物質耐性、および適切な起源。 製?…

Representative Results

このプロトコールで詳述OMVパッケージング戦略のために必要とされるように、2つの組換えタンパク質の同時発現は、異なる道の数を介して達成することができます。ここでは、2つのベクター系は、複製と独立した誘導性遺伝子カセットの互換性の起源で利用されました。 PTE-SCの発現のために商業的なプラスミド骨格(pACY184)を構築アラビノース誘導性遺伝子カセッ…

Discussion

代表性を実証するために、このプロトコル機能は、目的の酵素が生産され、 大腸菌によりOMVにパッケージ化されたパッケージング技術を指示しました。多くの複雑な技術と同様のプロトコルは以下に詳述されているいくつかの異なるユニークな用途での使用に適応するように変更することができる複数の領域が存在します。 OMVのパッケージングと酵素カプセル化のメカニズムは、特?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

Materials

IPTG Any Always prepare fresh or aliquot and freeze.
L-arabinose Any Can be prepared ahead of time and stored at 4C.
Ampicillin Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
Chloramphenicol  Any Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.  
TB/LB Culture Media Any Other growth medias will likely work similarly.
Triton X-100 Any One of many potential suitable surfactants.  
Baffled culture flasks Any The baffles promote higher levels of aeration.  
CHES Fisher Bioreagents BP318-100 Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8).
Paraoxon Chem Service N-12816 Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.  
Syringe Filter 0.45 µm Thermo Scientific 60183-221       (30 mm) Filter diameter will depend on volume of sample.  Low protein binding membrane is critical.
Shaker incubator New Brunswick Excella E24 Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. 
Sorvall Culture Centrifuge Thermo Scientific RC 5B PLUS Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.
Sorvall Ultracentrifuge  Thermo Scientific WX Ultra 90 Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g.
Ultracentrifuge Rotor Thermo Scientific AH-629 Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes        (25 x 89 mm) Beckman Coulter 344058 Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. 
Spectrophotometer  Tecan Infinite M1000 Necessary for enzyme kinetic assays.
DLS / particle tracking NanoSight  LM10 Necessary for OMV size distribution and concentration determination.  
BL21(DE3) NEB Suitable bacterial expression strain.
pET22 EMD Millipore 69744-3 Other plasmids can be used in place of these.  
pACYC184 NEB Other plasmids can be used in place of these.  
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Example kit.

References

  1. Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
  3. Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
  4. Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
  5. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
  6. Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
  7. Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
  8. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
  9. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
  10. Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
  11. Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
  12. Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
  13. Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
  14. Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
  15. Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
  16. Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
  17. Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
  18. Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
  19. Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
  20. Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
  21. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
  22. Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
  23. Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
  24. Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
  25. Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
  26. De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O’Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
  27. Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
  28. Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
  29. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
  30. Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).

Play Video

Cite This Article
Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification. J. Vis. Exp. (117), e54458, doi:10.3791/54458 (2016).

View Video