אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ<em> Coli Escherichia</em>: עיצוב, ייצור טיהור
Summary
A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.
Abstract
עניין גובר יישום טכניקות ביולוגיה סינטטיות לתכנת שלפוחית קרום חיצונית (OMV) מוביל כמה יישומים מעניינים וייחודיים מאוד עבור OMV שבו חלקיקים מסורתיים מוכיחים קשים מדי לסנתז. נכון להיום, כל חיידקים גראם שליליים הוכחו לייצר אריזות הוכחת OMV של מגוון מטענים הכוללת מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים החומר הגנטי. בהתבסס על המטענים המגוונים שלהם, OMV הם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, החלו מתקשורת תאי תאים כדי העברת גנים ואספקה של גורמים ארסיים התלויים בו חיידקים מפיקים את OMV. רק לאחרונה חיידקי OMV להיות נגיש לשימוש על פני מגוון רחב של יישומים באמצעות פיתוח טכניקות לשלוט ואריזה ישירה של חלבונים רקומביננטיים לתוך OMV. פרוטוקול זה מתאר שיטה לייצור, טיהור, ושימוש OMV ארוז אנזים מתן השתפר overaייצור ll של אנזים רקומביננטי, vesiculation גדל, ויציבות אנזים משופר. ניצול מוצלח של פרוטוקול זה יגרום ליצירת זן חיידקים אשר בו זמנית מייצר חלבון רקומביננטי ומפנה אותו אנקפסולציה OMV באמצעות יצירת זיקה סינטתית בין חלבון רקומביננטי חלבון עוגן הממברנה חיצוני. גם פרוטוקול זה מפרט שיטות לבידוד OMV מתרבויות חיידקים כמו גם טכניקות טיפול הולמות ודברים שיש להביא בחשבון בעת התאמת פרוטוקול זה לשימוש עבור יישומים ייחודיים אחרים כגון: משלוח סמי תרופות, אבחון רפואי, וטיפול סביבתי.
Introduction
אנו מציגים כאן שיטה בעיצוב, ייצור, וטיהור של שלפוחית הממברנה החיצונית חיידקי טעון אנזים (OMV). OMV הם קטנים, בעיקר unilamellar, proteoliposomes כי טווח בגודל 30-200 1,2 ננומטר. כל חיידקים גראם-שליליים גראם חיוביים כי נחקרו עד כה הוכיחו שחרור או OMV או שלפוחית תאיים (EV) מפני השטח שלהם 3,4. המנגנון המדויק שבו OMV מיוצר עדיין הובהר באופן מלא בשל אוכלוסיות חיידקים המגוונות אשר מפרישות אותם כמו גם את הפונקציות השונות, כי הם משרתים. OMV הוכח להובלת מגוון רחב של מטענים ממולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים ו החומר גנטי מגיש מגוון רחב של איתות מורכבת, טרנסלוקציה גן, ארסיות מתפקדת 5,6.
המנגנונים המדויקים של biogenesis OMV אינם מתאפיינים היטב, נראים שונה בין מינים של חיידקים. למרות תיהים למעשה, פתחנו שיטה לשיפור יעיל האריזה של חלבון רקומביננטי לתוך OMV ידי יצירת הצמדה סינטתית בין חלבון של עניין וכן אנדוגני חלבון הנפוץ ביותר בקרום החיצוני חיידקי OMV שלאחר מכן. בהיעדר זיקה סינטתית, או זיקה שולבה באופן מלאכותי, בין חלבון recombinantly הביע ואת OMV את יעילות האריזה הנצפית היא מאוד נמוכה 7. תוצאה זו היא צפויה כמו שילוב של חלבונים בתוך OMV גם מתרחשת דרך אנקפסולציה מקריות בדיוק ברגע של היווצרות OMV על פני השטח חיידקי או באמצעות אריזות בבימויו של המנגנונים אינם מובנים היטב. חלק ההצלחה נצפתה חלבוני אריזה פשוט דרך על ביטוי במרחב periplasmic המסתמך על אנקפסולציה מקרית אלא אריזה יעילה מאוד חלבון תלוי עם כמה חלבוני אריזה ביעילות גבוהה בהשוואה לאחרים הב- אינו לארוז בכלל 8-10. על ידי ניצול טכניקות ביולוגיה סינטתית משותפות חפשנו להנדס Escherichia coli (E. coli) לייצר בו זמנית, חבילה ומפרישי אנזים פעיל עניין לתוך OMV עוקף מגבלות ידע קיימות לגבי איך OMV נוצרת וכיצד מטען נבחר על-ידי החיידקים אריזה.
לעניין יישום זה מערכת bioconjugation חלבון פיצול נבחרת ההצמדה הסינטתית בחירה כדי להקל אריזה כיוונית לתוך OMV. כפי שהשם מרמז מערכת bioconjugation חלבון פיצול מורכבת משני תחומים למקטע ומשלימים אינטראקציה זה עם זה. תחומי חלבון הפיצול שנבחרו לצורך פרוטוקול זה המכונה SpyCatcher (SC) ואת SpyTag (ST) התחום נגזרים פיברונקטין מחייב pyogenes סטרפטוקוקוס החלבון (FbaB) 11. מערכת חלבון פיצול זה הוא יוצא דופן בכך wתרנגולת שתי יחידות המשנה הן בתוך קרבת אג"ח isopeptide יוצרת באופן ספונטני בין הפרוקסימלי אספרטית שאריות חומצת חומצה ליזין אמינו יצירת הצמדה קוולנטי. היווצרות קשר Isopeptide אינה דורשת תוספת של חלבונים מלווים, אנזימים קטליטי, או קו-פקטורים ויכולה להתרחש בקלות בטמפרטורת חדר (RT) על פני טווח רחב של מצבים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית 12.
כהוכחה מושג, phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) מ diminuta Brevundimonas נבחרה להיות ארוז לתוך E. coli נגזר OMV 13. PTE מכיל אתר binuclear Zn / Zn פעיל ויש לו את היכולת לשבור זרחנים אורגניים באמצעות תגובה הידרוליזה המרת aryldialkylphosphates לתוך dialkylphosphates ו כהלים aryl 14. חשיפה זרחנים אורגניים פוגעת בתפקוד העצבי הנכון דרך עיכוב הידרוליזה של אצטילכולין על ידי האצטילכולין בצמתים neuromuscular מאקיןתרכובות organophosphate נגזר g 15 מסוכן מאוד. ממושך או חשיפה משמעותית זרחנים אורגניים תוצאות נפוצות עוויתות בלתי נשלטת בדרך כלל גורם למוות באמצעות מחנק. בעוד PTE מציג את הפעילות הקטליטית הגבוהה ביותר כלפי paraoxon, דברה חזקה מאוד, הוא גם מסוגל hydrolyzing מגוון רחב של חומרי הדברה אחרות ו- V / G סוג גזי עצבים כימיים 16. כדי להקל על אריזת OMV, פלסמיד חיידקי תוכנן מקודד מבנה גן המכיל מקדם מושרה, רצף לוקליזציה periplasmic, ואתר שיבוט מרובה קצר במעלה זרם של רצף גן SC. החדרה של גן PTE בין מנהיג רצף SC מותר ליצירת מתג גנטי שמכוון את חלבון היתוך PTE-SC למרחב periplasmic לאריזת OMV. למרות שהמאמצים המתוארים כאן להתמקד PTE, גן האנזים הוא להחלפה יכול להיות מוחלף בקלות עם רצף גן אחר facאריזת ilitate של אנזים או חלבון חלופי.
כמו החלק השני של ההצמדה הסינטתית, חלבון הממברנה חיצוני בשפע (OmpA) נבחר להציג את רצף הפפטיד ST. בעוד הבחירה של חלבון עוגן יכול להשתנות, זה הכרחי כי החלבון יש דומיין מתירנית המציג במרחב periplasmic, סובל את ההיתוך לבנות ללא גרימת cytotoxicity, ידוע להיות נוכח OMV, ואינו מצטבר כאשר הוא recombinantly מיוצר. OmpA הוא חלבון 37.2 kDa הטרנסממברני Porin כי ידוע להיות מבוטא בכמות גבוהה בקרום החיצוני בקטריאלי ולאחר OMV 17. הוא מעורב התחבורה של מולקולות קטנות, <2 ננומטר בגודל, דרך הממברנה בקטריאלי 18. יש Native OmpA שני תחומים ייחודיים מבחינה מבנית, מוטיב חבית בטא הטרנסממברני וחלק periplasmically מסיס בטרמינל C-ידוע אינטראקציה עם 19 פפטידוגליקן. בשנות ה designe היתוך OmpA-ST מוטציהד כאן חלק מסוף-C של OmpA נמחק ואת ST היה התמזג N- periplasmically פונה או C-Termini. מחיקת חלק periplasmic של OmpA מקטינה את מספר האינטראקציות בין הממברנה החיצונית ואת פפטידוגליקן וכתוצאה מכך יציבות הממברנה מובילה Hyper-vesiculation 7. הגנום OmpA נשמרה בנוסף לבנות OmpA-ST הביע recombinantly להמתיק יציבות הממברנה ברוטו.
Protocol
Representative Results
Discussion
פונקציות פרוטוקול זה להפגין נציג מכוון טכניקת אריזה שבה אנזים עניין מיוצר וארוז לתוך OMV ידי E. coli. כמו עם טכניקות מורכבות רבות ישנם אזורים מרובים, בם הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להתאים לשימוש ביישומים ייחודיים שונים, שחלקם מפורטים להלן. בעוד מנגנון של אנקפסולצי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.
Materials
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS / particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
References
- Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
- Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
- Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
- Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
- Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
- Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
- Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
- Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
- Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
- Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
- Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
- Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
- Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
- Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
- Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
- Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
- Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
- Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
- Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
- Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
- Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
- De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O’Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).
- Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
- Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).
