מדידה כמותית של רמות חומצה רטינואית יחסית ב E8.5 עוברים neurosphere תרבויות באמצעות assay Reporter F9 נדיר- lacZ מבוססי תאים
Summary
Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.
Abstract
Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.
Introduction
חומצה רטינואית (RA) היא נגזרת מטבוליט של A רטינול או ויטמין מופק באמצעות פעילות רציפה של דהידרוגנאז הסלולר מספר 1. בגלל האופי הכימי amphiphatic שלה, שהוא חוצה ממברנות שומנים בדם בקלות יכול לפעול כגורם מסיסים המוךפו"גנטי שהולך 1. זוהי מולקולה חיונית המווסת תהליכים תאיים התפתחותיים מבוגרים רבים על ידי מתנהג כמו ליגנד לרצפטורים retinoid הגרעיני והפעלת ביטוי גני 2-10. ללא RA, קולטנים RA אלה (RARs) לאגד Rareş בדנ"א ולפעול repressors; RA קשירה לקולטנים אלה הופך אותם activators תעתיק וכתוצאה מכך ביטוי גן המטרה 1,5,6.
למרות מסלול איתות RA מאופיין היטב, בגודל הקטן (~ 300 Da) וטבע amphipathic של RA עושים ויזואליזציה היסטולוגית ישירה ומדידה של RA 11 כיום טכני ישימה. השיטה היחידה עבור dirמדידת ect של רמות RA היא באמצעות בידוד של RA ממדגמים רקמות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) 11. שיטה זו דורשת בדרך כלל כמויות גדולות של רקמה, בהנחייתם של איגום מדגמים שונים 12. לפיכך, טכניקה זו היא אינה מותאמת למדידת רמות RA בעוברי פרט או כמויות קטנות של מדגם / רקמות.
על מנת לחקור את הפונקציה הסלולרית של RA, מספר שיטות פותחו כדי להסיק את הנוכחות בעקיפין של RA. שיטות אלה לעשות שימוש במערכות כתב המכילות את RARE RAR-בטא תגובה מאוד נהיגת הביטוי של-galactosidase ביתא או בלוציפראז 11,13,14. עכבר כתב נדיר- LacZ המהונדס שנוצר על ידי Rossant et al. 13 הוא מערכת אידיאלית המאפשרים הדמית אזורי spatiotemporal של איתות RA באתרו 11,13,15,16 אבל אינו מתאים מדידות כמותיות. שורת תא נדיר- LacZ F9 14, על tהוא לעומת זאת, הוא שימושי עבור זיהוי של RA ו מדידות כמותיות של רמות RA ב explants רקמת 11,12,14,17,18.
F9 תאים teratocarcinoma להביע אלפא אנדוגני, בטא, וחומצה רטינואית-גמא קולטני 19, וליזום בידול לתוך endoderm הקודקודית לאחר חשיפה 19-21 RA. תאי F9 הוקמו עוד מודל ההתמיינות-induced RA, ולכן הוא נבחר קו תא אידיאלי עבור assay כתב RA. שורת התא העיתונאי F9 הנגזרת סיל-15 RA שנוצרה על ידי וגנר ואח '. 14 מכילה E. coli'LacZ גנים במורד הזרם של עותק אחד של אלמנט תגובה החומצה הרטינואית 64 נ"ב (RARE) של הקולטן חומצה בטא-רטינואית האדם גן (RAR-בטא). כדי לבחור ולשמור שיבוטים יציבים, המבנה מכיל גם את phosphotransferase aminoglycoside הגן (NEO r) כסמן לבחירה בנוכחות G418. שיתוף מבנה זהnfers ביטוי מושרה של-galactosidase ב בנוכחות RA, אשר ניתן דמיינו באמצעות מכתים LacZ ותגובה זו יכולה להיות ובהמשך לכמת באמצעות שיטות colorimetric 11,12,14,18.
שורת תאי כתב מאוד צדדי זה נעשה שימוש נרחב זיהוי של ייצור RA אנדוגני באמצעות שיתוף התרבות של דגימות רקמה עם תאי הכתב, כגון explants צלחת רצפת שבלול 17 ועוברים 14. בנוסף, קו הכתב הזה שימש במשך כימות של רמות RA בחוט השדרה פיתוח על ידי culturing סעיפים ונקווה של מיתרי השדרה עובריים בנפרד והוספת התקשורת מותנה מתרבויות אלה לתאים נדיר- LacZ F9 18. כימות בוצעה לאחר מכתים LacZ באמצעות קריאה colorimetric באמצעות קורא צלחת ELISA תקן 11,12,18. לבסוף, שורת תאי הכתב הזה נוצל בעבר זיהוי של הנוכחות של אנזימים מטבוליים RA ידי ניטורng שינויים ברמות RA 12,18.
כאן אנו מדווחים כי הרגישות של שורת תאי הכתב הזה גם מאפשרת המדידה של רמות RA שנוצרו מעוברים E8.5 שיתוף תרבותי פרט. זה מאפשר השוואה בין עבר הבודדים של גנוטיפים שונים. כדוגמה ספציפית, Gpr161 הוא GPCR יתום המווסת neurulation בין היתר, באמצעות מסלול איתות RA 22, ואנחנו מדווחים באמצעות שורת תאים הכתב הזה כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה רצסיבית ב Gpr161 (VL Gpr161) על רמות RA הכולל עוּבָּר. בנוסף לכך, את הרבגוניות וקלה לשימוש של מערכת הכתב הזה מאפשר את החופש למדוד ולהשוות רמות RA בדגימות רקמה שונות, אפילו בתרבויות neurosphere המתקבלות תאי גזע חוט שדרה מבוגרים. כאן אנו מתארים את הנחישות כמותית של רמות RA ביחס בעוברים ותרבויות neurosphere באמצעות שיתוף התרבות ישיר עם נציג F9 נדיר- LacZ RAשורת תאי orter.
Protocol
Representative Results
Discussion
השורה תא F9 נדיר- LacZ 14 היא מערכת רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם לצורך זיהוי של RA המיוצר על ידי explants רקמות 12,14,17,18. הוא רגיש לריכוזי RA נמוכים כמו 100 FM, ללא תגובה שאינה ספציפית זוהתה בתאים שלא טופלו עם 12,14,18 RA. יתר על כן, תאי הכתב להגיב לכל-trans RA באופן ליניארי בטווח מסוים של ריכוז, ובכך מאפשרים את תגובת LacZ להיות לכמת המשמשת לקביעת עוצמת רמות RA 12,14,18. את assay כתב RA הקל והמהיר המוצג כאן מנצל את שורת תאי כתב נדיר- LacZ F9 להדמיה (איור 2) ומדידת כמותית יחסית (איור 3) של עוברים ותאי גזע עצבי מבוגרים תרבותי. מערכת הכתב הזה מאפשר השוואה של רמות RA אנדוגני בין דגימות בודדות, כפי שמוצג באיור 2. הוא רגיש מספיק כדי להיות מסוגל לזהות RAשנוצר על ידי עוברי E8.5 בודדים (איור 2 א) וכן RA המיוצרים על ידי neurospheres התרבותי (איור 2 ב). התגובה תלויה במינון של שורות התאים כדי ריכוזים שונים של RA מאפשרת כימות של רמות RA (איור 3 א) בדגימות וכן השוואה של רמות היחסיות RA בין הדגימות (איור 3 ב). חשוב לציין כי הקו הסלולרי כתב F9 RARE מודד את הסכום הכולל של RA שנוצר על ידי דגימות הרקמה לאורך זמן דגירה. זה שווה המאזן הנטו של סינתזת RA ו פירוק.
בעוד מערכת כתב נדיר- LacZ תא F9 רגישה מאוד תכליתי, ישנם מספר צעדים לפתרון בעיות קריטיים שאנחנו נשלב כדי להבטיח את האמינות של מערכת זו. ראשית, כפי שמוצג באיור 1, חשוב לשמור על הבריאות של תאים אלה על ידי קטעים רגילים בלי לתת להם גרמולחתור אל confluency. שנית, ראינו מאוחר יותר קטעים נוטים לגרום לתגובות RA עולות בקנה אחד, גם אם התרבויות נשמרות כל זמן תחת בחירה עם G418. כדי לפתור בעיה זו, מומלץ להשליך תרבויות אחרי 20 קטעים להפשיר בקבוקון חדש. בנוסף, חייבות להתבצע בדיקות תקופתיות על מנת להבטיח כי תאי הכתב עדיין המגיבים חזק לנוכחות של RA בתקשורת. שלישית, אם הקטעים הראשונים להציג תגובה ירודה או לא אחידה כדי RA (איור 1B, משמאל), אחד או מספר סבבי subcloning עשוי להיות נחוץ עד מגיבים חזקים מתקבלים (האיור 1B, righ t). לבסוף, לפני התרבות משותפת, מומלץ כי דגימות רקמה כגון עובר neurospheres הם ניתקים תאים בודדים. ראינו דיסוציאציה כי תוצאות הדגימות במדידות colorimetric עקביות יותר. זה יכול להיות בגלל חלוקה אף יותר של RA בבארות התרבות, כמו התאים הניתקים נמצאים חדטופס יצירת קשר עם תאי הכתב.
מספר שינויים נעשו גם הפרוטוקול המקורי 14. ראשית, תגובת RA של התאים הנדיר-LacZ F9 כומתו על ידי תיקון התאים ומדידת ספיגה ישירות ב 610 ננומטר במקום איסוף תאים וניתוח lysate לפעילות ב-galactosidase 14. שינוי נוסף הוא שיתוף התרבות הישירה של דגימות ניתקו עם F9 נדיר- LacZ לפני כימות בתגובת RA. שיטות קודמות דיווחו culturing דגימות בנפרד והוספה רק תקשורת מתרבויות אלה F9 נדיר- LacZ 16,18.
למרות היותה מערכת עוצמה, assay הכתב נדיר- LacZ F9 יש מספר מגבלות. מגבלה אחת של שורת תאים הכתב הזה הוא כי על אף שהוא מגיב חזק בנוכחות כל-trans RA, זה גם מגיב איזומרים החומצה הרטינואית אחרים כולל 9-cis-RA ו -13-cis-RA; עם זאת, הם פי 100 יותר רגישים לכל-trans RA compaאדום איזומרים האחר 18. מגבלה נוספת למערכת זו היא שהתגובה ליניארי תלוי במינון נופלת רק בין 10 -13 M 10 -7 M ב-RA 14,18; וכך, אם משווים רמות RA מחוץ לגבולות אלה, ייתכן שיהיה צורך לבצע דילול סדרתי של המדגם עד המדידות ליפול בטווח ליניארי. לבסוף, שכן מדובר assay colorimetric בעיקר, נקודת הסיום של התפתחות צבע ינוע בין דגימות וניסויים. לפיכך, חשוב כי עקומת סטנדרט תמיד להיות מצופית במקביל עבור כל ניסוי יחיד כדי להשתמש בו עבור כימות של תגובת תא כתב.
לסיכום, יש לנו דיווח השימוש של הקו הסלולרי הכתב F9 נדיר- LacZ RA כדי למדוד את רמות RA כמותית בעוברים E8.5 ו, בעבר שלא דווחו מבוסס, neurospheres. הרבגוניות של מערכת הכתב הזה עשויה לאפשר כימות של רמות RA כמעט לכל סוג תא או רקמה, ו- mאיים לגרום להתפתחות של יישומים מגוונים בעתיד.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) for providing us with the F9 RARE-LacZ cells and technical support. This study is funded by the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (Grantnumber:10-3092-SCR-E-0) and the New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (Grant number: CBIR13FEL006).
Materials
| C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain | Jackson Laboratory | 000316 | |
| F9 RARE-LacZ reporter cell line | from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | ||
| DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 C for media preparation |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive |
| G418 | ThermoFisher Scientific | 10131-027 | Store at 4 °C; light-sensitive |
| 2% Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Store at 4 °C |
| B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation |
| Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 °C |
| Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic | PeproTech | 450-33 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 °C |
| 50% glutaraldehyde | Amresco | M155 | Store at 4 C |
| Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | Store at room temperature |
| potassium ferrocyanide (K₄[Fe(CN)₆] · 3H₂O) | Sigma Aldrich | P-9387 | Store at room temperature |
| potassium ferricyanide (K₃[Fe(CN)₆]) | Sigma Aldrich | P-8131 | Store at room temperature |
| X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) | Promega | V3941 | Store stock at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | Store at room temperature |
| all-trans Retinoic Acid (at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light |
| TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | Store at room temperature |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | Store at 4 C |
| 10X phosphate buffered solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Store at 4 C |
| Papain | Worthington | LK003176 | Store at 4 °C. |
| Trypsin | Worthington | LS003703 | Store in 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Hyaluronic acid | Calbiochem | 385908 | Store 200 μl aliquots at -20 °C. |
| DNaseI | Worthington | LS002139 | Store in 200 μl aliquots at -20 C |
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich | K3375 | Store in 200 μl aliquots at -20 C |
| 95% ethanol | |||
| Mr. Frosty Freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| 10 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 10 cm culture dish (cell culture treated) | |||
| 6 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
| 96-well cell culture plates | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml amber microcentrifuge tubes | |||
| 1.5 ml cryovials | |||
| 37 °C water bath | |||
| surgical scissors | |||
| fine surgical scissors | |||
| no. 5 forceps | |||
| blunt-ended forceps | |||
| scalpel blade | |||
| glass pasteur pipettes | |||
| cotton | |||
| alcohol lamp | |||
| ELISA plate reader | |||
| stereomicroscope |
References
- Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. Retinoic acid. Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).
- Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the functioning brain. Science Signalling. 324, 1-3 (2006).
- Lane, M. A., Bailey, S. J. Role of retinoid signalling in the adult brain. Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).
- Maden, M. Retinoid signalling in the development of the central nervous system. Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).
- Maden, M. Retinoids and spinal cord development. J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression. J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).
- Ang, H. L., Duester, G. Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1. Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).
- Bastien, J., Rochette-Egly, C. Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes. Gene. 328, 1-16 (2004).
- Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice. Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).
- Sakai, Y., Drager, U. C. Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes. Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).
- Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain. Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).
- Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis. Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).
- Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay. Development. 116, 55-66 (1992).
- Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain. Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).
- Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites. J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).
- Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture. Development. 119, 1041-1053 (1993).
- McCaffery, P., Drager, U. C. Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord. Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).
- Hu, L., Gudas, L. J. Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells. Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).
- Martin, G. R. Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis. Science. 209 (4458), 768-776 (1980).
- Strickland, S., Mahdavi, V. The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid. Cell. 15 (2), 393-403 (1978).
- Li, B. I., et al. The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation. Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).
- Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (1986).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).
