Mesure quantitative des niveaux relatifs à l'acide rétinoïque E8.5 Embryons et Neurosphère Cultures Utilisation du F9 RARE-Lacz base de cellules Reporter Assay

Tous les travaux de l'animal a été fait selon les méthodes Rutgers-RWJMS IACUC approuvés. 1. Solution et préparation des médias Préparer stocks tampons et solutions selon le tableau 1. Préparer des solutions de travail selon le tableau 2. 2. Culture et entretien des cellules F9 RARE-LacZ Les cellules congelées Dégel Préparer un milieu de culture de cellules F9 RARE-LacZ comme indiqué dans le tableau 2. Manteau 10 cm boîtes de culture (culture de cellules traitées) avec 10 ml de gélatine à 0,2% (voir le tableau 2) pendant 30 min à température ambiante. Laver l'excès de gélatine avec deux rinçages de 10 ml d'eau distillée. ajouter immédiatement 9 ml de milieu de culture de cellules F9 RARE-LacZ dans la fiole pour empêcher la gélatine de séchage. Décongeler une fiole de cellules RARE-LacZ F9 14 dans un bain à 37 ° de l' eau pour 2 – 3 min. Cellules en plaques (environ 1 x 10 6 cellules / ml) dans le plat enduit contenant 9 ml de milieu de culture. La culture à 37 ° C, 5% de CO 2. Changer le moyen le lendemain. Maintien de F9 cellules RARE-LacZ Maintenir un passage régulier tous les 2 – 3 jours à un rapport de 1:10. Remarque: Ne laissez pas les cellules croissent en confluence que cela se traduira par leur différenciation. Diviser les cultures à une confluence de 80-90%. Retirez les médias et laver les cellules avec 10 ml de 1x tampon phosphate salin (PBS). Retirez le PBS et ajouter 1 ml de trypsine, incuber pendant 5 min. Ajouter 9 ml de milieu de culture, une pipette de haut en bas et de diviser les cellules 1h10 pour le passage. Congélation F9 cellules RARE-LacZ Trypsiniser un plat de 10 cm contenant des cellules RARE-LacZ F9 à 80 – 90% de confluence comme détaillé dans l'étape 2.2.2. Transférer les cellules dissociées dans un tube et un essorage centrifuge 15 ml à 200 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant et le culot de cellules remise en suspension dans 10 ml de F9 RARE-LacZ freezing moyen (voir le tableau 2). Aliquoter 1 ml en cryotubes étiquetés et flacons de transfert dans des récipients de congélation. Placer le gel récipient dans -80 ° C congélateur O / N et de transfert des flacons à réservoirs d'azote liquide le lendemain. 3. Dissection de E8.5 Embryons Accouplement Cage Set-up et Plug Check Mise en place d'une cage d'accouplement contenant une paire d'accouplement. Le matin du jour suivant, vérifier la présence d'un bouchon vaginal et de désigner le jour un bouchon se trouve que le jour 0,5 23. A E8.5 jour, les embryons de récolte. Dissection de Embryons Sacrifiez le barrage par dislocation cervicale et pulvériser la zone abdominale avec 70% d' éthanol (voir le tableau 2). Faire une coupe transversale à la peau au-dessus de l'abdomen à l'aide des ciseaux chirurgicaux et tirez les deux volets de l'autre (antérieur et postérieur) pour exposer la région abdominale. Faire une coupe similairesur le péritoine pour exposer l'abdomen. Repérez le col et la libération de l' utérus des trompes de Fallope et mésomètre en utilisant une paire de ciseaux 23. Placez le col dans une boîte de 6 cm (culture non-cellule traitée) avec 10 ml PBS 1x pour laver l'excès de graisse et de sang. Transfert à un autre plat de 6 cm contenant 10 ml frais 1x PBS. Séparée d'un utérus contenant un embryon en le coupant avec des ciseaux chirurgicaux. Retirer l'utérus et decidua et libérer le sac de jaune contenant l'embryon en utilisant deux paires de pas. 5 pince 23. Séparer le vitellus de l'embryon, et le transfert du sac vitellin d'un microtube de 1,5 ml pour l'extraction d'ADN génomique à être utilisé pour le génotypage. Utiliser une pipette P20 avec une pointe de gros calibre, transférer l'embryon entier dans un tube de 1,5 ml contenant 10 pi de trypsine. Placer le tube sur la glace. Répétez les étapes 3.2.3 – 3.2.4 jusqu'à ce que tous les embryons ont été disséqués. Embryo dissociation Incuber les tubes de 1,5 ml contenant des embryons à la trypsine à 37 ° C pendant 5 minutes pour faciliter la dissociation enzymatique. Triturer doucement à l'aide d'une pipette P20 pour la dissociation mécanique de l'embryon, et l'assiette du volume total de 10 ul contenant un embryon dissocié sur un puits de cellules RARE-LacZ F9 dans une plaque à 96 puits (voir étape 5.1 pour le placage des cellules F9 RARE-LacZ dans une plaque de 96 puits). La culture O / N à 37 ° C et 5% de CO 2. 4. laminectomie, Dissection des adultes de la moelle épinière lombaire et Neurosphère Culture laminectomie Sacrifiez un adulte (P60) la souris par dislocation cervicale. Pulvériser la face dorsale avec 70% d'éthanol et faire une coupe transversale en utilisant des ciseaux chirurgicaux. Tirez sur les deux volets (antérieur et postérieur) en dehors pour exposer le dos et la colonne vertébrale. Avec des ciseaux chirurgicaux, couper les muscles couvrant la colonne vertébrale.Localiser la région lombaire de la moelle épinière, au-dessous des nervures. À l'aide des ciseaux, faire une coupe profonde de rompre la colonne vertébrale à ce stade pour exposer la moelle épinière. Tirez la région lombaire de la colonne vertébrale sans. 5 forceps de telle sorte que la section transversale exposée de la moelle épinière, fait face à l'expérimentateur. En utilisant les conseils de ciseaux fins, coupez la vertèbre et de muscle au niveau des positions 3 et 9 heures de l'extrémité exposée. Saisissez le volet dorsale de la vertèbre coupé avec une pince. Continuer jusqu'à ce que ces coupures caudale la longueur de la moelle épinière lombaire est exposée. Relâchez la moelle épinière des vertèbres en utilisant pas. 5 ainsi que des pinces à bouts francs. Transférer la moelle épinière à un tube de 15 ml contenant 3 ml de milieu DMEM / F12 de culture. Gardez sur la glace jusqu'à ce que tous les cordons de la colonne vertébrale lombaire ont été isolés. Spinal Cord Dissection Verser le milieu de culture avec de la moelle épinière dans une boîte de 6 cm (culture non traitée cellulaire). En vertu d'un stéréomicroscope, enlever les ganglions de la racine dorsale et les vaisseaux sanguins autour du segment de la moelle épinière en saisissant les ganglions et les vaisseaux sanguins en utilisant deux paires de pas. 5 pinces et en les tirant doucement de la moelle épinière. Transférer le segment de la moelle épinière dans une boîte de 6 cm sans support et hacher finement le tissu à l'aide d'une lame de scalpel. Transfert tissu haché à tube de 15 ml contenant 1 ml de milieu Neurosphère de dissociation (voir le tableau 2). Déposer le tube sur la glace et répétez les étapes 4.2.1 – 4.2.2 jusqu'à ce que tous les cordons de la colonne vertébrale ont été traitées. Incuber les tubes contenant du tissu haché dans un milieu de dissociation à 37 ° C pendant 10 min, effleurer le tube sur le côté pour mélanger et incuber à 37 ° C pendant encore 10 min. Après digestion enzymatique, trituré avec des pipettes polies au feu de diamètres décroissants pour la dissociation mécanique. Note: Préparer pipettes poli-feu de diamètres décroissants avant d'effectuer des expériences. Prendre un verre Pasteurpipette et branchez l'extrémité large avec du coton propre. L'utilisation d'une lampe à alcool, le feu polish les pointes des pipettes dans la flamme pour créer différents diamètres: "régulière", "fine" et "extra fin". Pour pipettes polies «réguliers», virevolter la fin de la pipette dans la flamme au tour des bords sans diminuer le diamètre (~ 1 mm). Faites pivoter l'extrémité de la pipette dans la flamme pour un peu plus longtemps pour créer "fine" (~> 1 mm et> 5 mm de diamètre) et "extra fin" (~ 0,5 mm) pipettes polies. Ne pas utiliser pipettes avec des diamètres inférieurs à 0,5 mm. neurosphère Culture Isoler des tubes contenant dissociées du tissu de la moelle épinière à 200 xg pendant 10 min. Retirer le surnageant et le culot de cellules remettre en suspension dans 1 ml de milieux de culture de neurosphères (voir le tableau 2). Triturer avec une pipette P1,000 suivie d'une pipette P200 pour faciliter la dissociation. Remarque: évitez les bulles d'introduction,ce qui diminuerait la viabilité cellulaire. Transfert de 10 ul de cellules dissociées dans un hémocytomètre et d'obtenir une numération cellulaire. Des cellules en plaques à une densité de 1×10 5/10 ml dans un flacon T25 avec 10 ml de milieux de culture de neurosphères. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 7 jours jusqu'à ce que neurosphères 24 apparaissent. neurosphère dissociation Recueillir la culture Neurosphère et transfert à tubes de 15 ml. Spin à 200 xg pendant 10 min. Retirer la plupart du surnageant en laissant 1 ml derrière. Triturer avec une pipette P1,000 pour remettre en suspension le culot de cellules et de se dissocier neurosphères dans des cellules individuelles. Transfert 10 pi de cellules dissociées dans un hémocytomètre et d'obtenir un nombre de cellules. Planche 1 x 10 5 dissociées cellules de neurosphères sur un puits de F9 RARE-LacZ dans une plaque à 96 puits (voir rubrique 5.1 pour placage F9 RARE-LacZ en plaque de 96 puits). Plaque 3 puits comme répétitions. La culture O / N à 37 ° C et 5% de CO 2. 5. RA Dosage de E8.5 Embryons et la moelle épinière Neurosphères Placage F9 RARE-LacZ en plaque de 96 puits Un jour avant la récolte des embryons E8.5 ou dissociation de neurosphères, enduire une plaque de 96 puits avec 100 ul de 0,2% de gélatine par puits pendant 30 min à température ambiante. Aspirer la gélatine et rincer deux fois avec 200 pi d'eau distillée. Trypsiniser F9 cellules RARE-LacZ maintenus en boîtes de 10 cm comme indiqué à l'étape 2.2.2. Planche 1 x 10 5 cellules / puits de cellules LacZ F9-RARE, mais cette fois en utilisant un milieu de culture sans G418. Préparer suffisamment de puits pour la co-culture d'embryons (~ 12-20, selon la taille de la litière), neurosphères (3 puits / génotype), ainsi que pour une courbe standard en triple (27 puits). Co-culture de F9 RARE-LacZ et E8.5 Embryons ou la moelle épinière Neurosphères embryons de récolte comme détaillé dans la section 3.2 et la plaque sur le dessus de F9RARE-LacZ dans la plaque de 96 puits de la section 5.1. D'une manière similaire, dissocier neurosphères et plaque sur le dessus de F9 RARE-LacZ dans la plaque 96 ainsi que détaillée à l'étape 4.4. La culture O / N à 37 ° C et 5% de CO 2. Génération d' une courbe standard Pour générer une courbe standard, préparer tout-trans RA (au-RA) des solutions avec les concentrations suivantes: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 22:00, 13:00, 100 fM, par dilution en série de l'at- RA stock (voir le tableau 1) avec un milieu de culture RARE-LacZ F9. Ajouter 100 pi de ces différentes au-RA concentrations aux cellules RARE-LacZ F9 de la section 5.1. Attribuer des puits contenant des cellules RARE-LacZ F9 non traitée comme contrôle négatif. Préparer triplicats de chaque concentration de la polyarthrite rhumatoïde et les puits témoins négatifs. La culture O / N à 37 ° C et 5% de CO 2. Remarque: Les cellules rares LacZ-F9 réagissent d'une manière linéaire, dose-dépendante à des concentrations variables de la polyarthrite rhumatoïde tout-trans. RA Assay Après O / N culture de la plaque de 96 puits contenant les courbes standard et co-cultures, retirez le support et fixer les cultures en ajoutant 100 pi de glutaraldéhyde à 2,5% (voir le tableau 2) pendant 15 min, RT. Retirer le fixateur et laver deux fois avec 200 pi de PBS 1x, 10 min par lavage. Retirer le PBS et laver trois fois avec 200 pi de la solution de lavage de LacZ (voir le tableau 2), 10 min par lavage. Au cours du troisième lavage, préparer la solution de coloration de X-gal dans un tube de 15 ml enveloppé dans une feuille (voir le tableau 2). Calculez combien de solution de coloration est nécessaire et préparer la quantité appropriée (200 pl / puits). Remarque: solution coloration X-gal est sensible à la lumière. Utiliser la solution de coloration dans les 15 minutes après la préparation. Préparer une chambre humidifiée en plaçant une serviette en papier imbibé d'eau distillée dans un récipient en plastique assez grand pour contenir une plaque de 96 puits. Ajouter 200 ul de Xsolution de coloration par gal puits de la plaque à 96 puits et placer la plaque dans une chambre humidifiée. Incuber chambre humidifiée contenant la plaque de 96 puits à 37 ° C pour permettre le développement d'un précipité de couleur bleue. Pour les embryons de E8.5, incuber la plaque O / N (12-16 h). Pour neurosphères cultures, incuber la plaque pendant 4-8 heures. Lecture Absorbance à OD 610 et Imagerie Après la réaction de couleur, éliminer la solution LacZ de coloration et le remplacer par 200 ul PBS 1x. Mesurer l'absorbance à 610 nm en utilisant un lecteur de plaque ELISA standard pour quantifier la réponse du rapporteur à la PR. Image puits individuels en utilisant un stéréomicroscope standard équipé d'une caméra. 6. Sous-clonage de cellules F9 RARE-LacZ Vérification F9 RARE-LacZ rResponse à RA Avant de commencer toute expérience, tester la réponse des cellules RARE-LacZ F9 à RA. Plaque F9 RARE-LacZ caunes en plaque de 96 puits (voir section 5.1), et ajouter 1 nM tous les trans-acide rétinoïque (voir étape 5.3). Incuber dans une chambre humidifiée à 37 ° CO / N. Visualisez le développement de précipité de couleur bleue à l'aide d'un microscope. Si le développement de la couleur est pas uniforme dans les cellules dans le puits (voir la figure 1B, à gauche), effectuer le sous – clonage détaillé ci – dessous. Sous – clonage de cellules F9 RARE-LacZ Fractionner les cellules RARE-LacZ F9 cultivées en boîtes de 10 cm comme indiqué à l'étape 2.2.2. Au lieu d'un rapport de 1:10, une plaque à faible densité d'ensemencement de 1 x 10 5 cellules / 10 ml dans une boîte de 10 cm pour permettre la croissance de colonies isolées , de telle sorte que chaque colonie provient d'une seule cellule F9 RARE-LacZ. Au bout de deux jours, une couche de plaque à 24 puits avec 500 ul de gélatine à 0,2% dans chaque puits pendant 30 min. Retirer la solution de gélatine et rincer les puits deux fois avec 500 pi d'eau distillée. Remplacer l'eau avec 500 pi de milieu de culture de cellules F9 RARE-LacZ. Choisissez une colonie en utilisant une pointe de pipette stérile P10 et le transfert dans un puits; faire cela 24 fois pour obtenir 24 colonies individuelles. La culture à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 3 – 4 jours. Diviser les colonies individuelles en deux plaques à 24 puits. Après 2 jours de culture, ajouter 1 nM de RA à chaque puits d'une plaque et de la culture de 24 puits O / N. Effectuer LacZ coloration comme détaillé dans la section 5.4 pour tester forts répondeurs. Visualisez la réaction de couleur de chaque puits sous un microscope pour déterminer les intervenants forts et uniformes. Une fois que le répondeur sous-clone solide est déterminé, développer la culture correspondante de l'autre plaque de 24 puits. élargir cette colonie dans un plat de 10 cm, le gel jusqu'à plusieurs flacons comme indiqué dans la section 2.3, et jeter toutes les autres colonies. Remarque: Seulement environ un quart des colonies d'origine résultat en haute répondeurs. En règle générale, le premier tour des sous-clonage ne se traduit pas par une coloration LacZ uniforme et une ronde ultérieure de sous-clonage doit être fait pourobtenir des intervenants solides uniformes.