De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics

Grootschalige data-analyse op basis van de genomen, transcriptomes, proteomen en metabolomes van planten biedt ongekend inzicht in het gedrag van complexe systemen, zoals de streek kenmerken van wijn die de interacties tussen grapevine planten en hun omgeving weerspiegelen. Omdat de streek van een wijn duidelijk kan zijn, zelfs wanneer identieke grapevine klonen worden gekweekt in verschillende wijngaarden, genomics-analyse is van weinig nut, omdat het klonen genomen zijn identiek. In plaats daarvan moet kijken naar correlaties tussen genexpressie en de metabolische eigenschappen van de druiven waarvan de kwaliteitskenmerken wijn bepalen. De analyse van genexpressie op het niveau van de transcriptoom voordelen van de vergelijkbare chemische eigenschappen van alle transcripten, kwantitatieve analyse vergemakkelijkt door gebruik algemene kenmerken zoals hybridisatie met geïmmobiliseerde probes op microarrays. Daarentegen universele analysemethoden in een proteomicsnd metabolomics zijn meer uitdagend vanwege de enorme fysieke en chemische diversiteit van individuele eiwitten en metabolieten. In het geval van metabolomics deze diversiteit is nog extremer omdat individuele metabolieten sterk verschillen in grootte, polariteit, overvloed en de volatiliteit, dus geen enkele extractieproces of analytische methode biedt een holistische benadering.

Onder de analytische platforms geschikt voor niet-vluchtige metabolieten, die uit hoogwaardige vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (HPLC-MS) zijn veel gevoeliger dan alternatieven zoals HPLC met ultraviolet of diode array detector (HPLC-UV, HPLC-DAD ) of kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopie, maar kwantitatieve analyse met HPLC-MS kan worden beïnvloed door verschijnselen zoals matrixeffect en ion onderdrukking / verbetering ^1-3. Het onderzoek naar dergelijke effecten bij de analyse van Corvina druivenbessen met HPLC-MS met behulp van een elektrospray ionisatiebron (HPLC-ESI-MS) toonde dat suikers of andere moleculen met de laagste retentietijden waren sterk underreported, waarschijnlijk mede als gevolg van het grote aantal moleculen in deze zone, en dat de overvloed aan andere moleculen kan worden onderschat, overschat of beïnvloed door de matrixeffect , maar de gegevens normalisering van de matrix effect leek te beperkte impact hebben op de algemene resultaten ^{van 4,5} te hebben. De hierin beschreven werkwijze is geoptimaliseerd voor de analyse drager polariteit metabolieten die zich ophopen bij hoge niveaus druivenbessen tijdens het rijpen en die aanzienlijk worden beïnvloed door de streek. Zij omvatten anthocyanen, flavonolen, flavan-3-ols, procyanidins, andere flavonoïden, resveratrol, stilbenen, hydroxykaneelzuren en hydroxybenzoëzuur zuren, die samen de kleur, smaak en gezondheid-gerelateerde eigenschappen van wijnen te bepalen. Andere metabolieten zoals suikers en alifatische organische zuren, worden genegeerd omdat kwantificatie met HPLC-MS onbetrouwbaar door de matrix en effect en ion onderdrukking verschijnselen ^5. Binnen het bereik polariteit geselecteerd door deze werkwijze is de benadering irrelevante omdat hij tot doel zoveel mogelijk verschillende metabolieten detecteren mogelijk ^6.

Transcriptomics methoden die het mogelijk maken duizenden grapevine transcripten gelijktijdig te bewaken worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid van de volledige grapevine genoomsequentie ^7,8. Vroege transcriptomics methoden op basis van hoge doorvoer sequentiebepaling cDNA geëvolueerd met de komst van de volgende generatie sequencing in een verzameling procedures collectief omschreven als RNA-Seq technologie. Deze aanpak is hard op weg de methode van de keuze voor transcriptomics studies. Echter een grote hoeveelheid literatuur gebaseerd op microarray, waarmee duizenden transcripten parallel worden gekwantificeerd door hybridisatie is opgebouwd voor wijnstokken. Sterker nog, voor RNA-Seq werd een mainstream-technologie, hadden vele toegewijde commerciële microarray platformenontwikkeld waardoor grapevine transcriptoom in detail te inspecteren. Onder de grote verscheidenheid aan platforms, slechts twee toegestaan genoom-brede transcriptoom analyse ^9. De verst ontwikkelde matrix kon de hybridisatie van tot 12 onafhankelijke monsters op een enkel apparaat, waardoor de kosten van elk experiment verminderen. De 12 sub-arrays elk omvatte 135.000 60-mer probes die 29.549 grapevine transcripten. Dit apparaat is gebruikt in een groot aantal studies ^10-24. Deze twee platforms zijn inmiddels gestopt, maar een nieuwe aangepaste microarray is onlangs ontwikkeld en vertegenwoordigt een meer recente ontwikkeling als het een nog groter aantal probes die extra nieuw ontdekte genen grapevine ²⁵ bevat.

De grote verkoop datasets geproduceerd door transcriptomics en metabolomics analyse vereisen een geschikte statistische methoden voor data-analyse, met inbegrip van multivariate technieken om correlaties tussen de verschillende vorm bepalens data. De meest gebruikte multivariate technieken zijn die op basis van projectie, en deze kunnen zonder toezicht, zoals principale componenten analyse (PCA), of worden gecontroleerd, zoals bidirectionele orthogonale projectie latente structuren discriminerende analyse (O2PLS-DA) ^26. Het protocol in dit artikel maakt gebruik van PCA voor de experimentele data-analyse en O2PLS-DA om de verschillen tussen groepen van de monsters te identificeren.