içinde Yırtıcı Beslenme Davranışları tahlil<em> Pristionchus</em> Ve Diğer Nematodlar

1. Ağız formu Fenotiplendirme Agaroz Pads ağız Formu Kimlik Not: nematod ağız morphs görselleştirmek agaroz pedleri üzerinde hafif bir anestezik tedavi ile solucanlar hareketsiz ve aşağıdaki gibi gözlemlemek amacıyla. Büyümek ve P. olarak nematod kültürleri korumak pacificus 6 cm standart nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları ve E. bakteriyel çim beslemek E. coli OP50 19. Ilk 3 mi,% 2 agaroz solüsyonu yapmak üzere 15 ml bir tüp içinde 3 ml H2O 0.06 g agarozun ekleyerek agaroz pedleri sağlayın. Bu 4 ° C'de bir yıla kadar saklanabilir Mix ve bir mikrodalga iyice agaroz eritmek ya da alternatif> 88 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğu kullanmak tamamen eritildiği sonra, agaroza% 10 sodyum azid çözeltisi 10 ul ekleyin ve iyice karıştırın. DİKKAT: Kuru sodyum azid reaktiftir ve her türlü toksiktir. 1 ml kullanılarakmikropipet, standart cam mikroskop lamı ortasında üzerine sıvı agaroz azid karışımı en az 300 ul bir damla yerleştirin. ağar soğutur önce hızlı bir şekilde soğutulması üzerine bir yastık oluşturan agaroz düzleştirmek için damla üstünde ikinci bir mikroskop lamı yerleştirin. gerekli olduğu kadar çok pedler için tekrarlayın. birbirini onları kaydırarak, soyma ayrı cam mikroskop slaytlar kullanımdan hemen önce. Not: Agaroz pedleri çok önceden hazırlanmış ise onlar aşırı kuru olabilir ve nematod zarar verebilir. ped merkezi üzerine – (3 ul 2) anestezik agaroz pedleri solucanlar aktarmak için, M9 tampon bir damla yerleştirin. Alış 2-3 genç P. pad üzerinde dikkatlice bir kapak kayma yerleştirmeden önce M9 damla içine pacificus yetişkinler. P. pacificus nematod agaroz hareketsiz ve görselleştirmek için hazır olacaktır. Uygun bir mikroskop a kadar anestezi solucan içeren mikroskop lamı aktarınnd 63X Nomarski optik altında gözlemlemek. aşağıdaki özelliklere göre Morph kimlikleri kategorize: ilave bir alt-ventral diş büyütülmüş dorsal diş ve geniş ağız açıklığı varlığı, eurystomatous ağzı Morph hayvan göstergesidir tek dorsal diş ve dar ağzı açıklığının bulunması, stenostomatous gösterir iken hayvan (Şekil 1). Not: Hayvan sağlığını korumak için, solucan en fazla 5 dakika boyunca agar yastığı muhafaza edilmelidir. ağız Morph belirlenmesinden sonra, yavaşça agaroz pedi kapalı kaydırarak kapak kayma kaldırarak gerektirdiği eurystomatous veya stenostomatous ya nematod kurtarmak. Dikkatle agaroz pad seçilen hayvan almak taze NGM plakalar üzerine (E.coli OP50 o stickier yardımcı olmak için çekme kullanılabilir). Normal hareketli davranış hayvanlar daha yırtıcı deneyleri için hazır bunun üzerine kaldığı yerden devam ediyor kadar anestezi kurtarma izin verin. <li> Hızlı Ağız Fenotiplendirme Not: Alternatif olarak, daha fazla deneyime sahip, ağız form tipi yüksek büyütme (150X) ile bir stereomikroskop üzerinden herhangi bir anestezik tedaviye gerek kalmadan test edilebilir. E. bakteriyel çim ile standart NGM plakalar üzerinde yer nematodları mikroskop görüntüleme alanı üzerine E. coli OP50. ağız büyüklüğüne ve genişliğine farklılıkları tespit. Not: yapılar gibi hiçbir diş nedenle ağız morph kimlik sadece dar ağızlarına karşı geniş ağızlara dayanan gözlemlenebilir Bu büyütme. 2. Bite Deneyi Not: Isırma tahlilleri detaylı bir yırtıcı davranış analizi izin verir. Büyümek ve standart NGM plakalar (6 cm) nematod kültürleri korumak ve E. bakteriyel çim beslemek E. coli OP50 19. C gibi seçilen av nematod kurtçuklarının sürekli uygulanması büyük miktarda büyüyerek tahlil plakaları yapmak elegans veya alternatively uygun bir ekolojik ilgili av. Not: Yetişkin C. o larva sahne kullanmak önemlidir bu yüzden elegans uygun av olamayacak kadar büyüktür. C koruyun elegans veya E. bakteriyel çim standart NGM plakalar ve yem diğer potansiyel av türleri E. coli OP50 nüfus taze genç L1 larva bir bolluk sonuçlanan hasret kadar. Not: açlık zamanı kültürü başlatmak için kullanılan nematod sayısı, E. miktarı da dahil olmak üzere çok sayıda çevresel ve deney faktörlere bağlıdır E. coli OP50 ilave edildi ve ortam sıcaklığına bağlıdır. M9 ile dört veya daha fazla taze hasret av tabakları yıkamak ve 15 ml tüp içinde toplamadan önce tüm büyük hayvanlar ve kalan yumurta kaldırmak için iki adet 20 mikron filtreler aracılığıyla solucan çözümü geçmektedir. Sadece küçük larvalar çözeltide kalmalıdır. Bir larva pelet 1 dakika boyunca 377 xg'de süzülür av santrifüj oluşturmak. <li> Hiçbir E. ile 6 cm NGM plaka üzerine saf solucan pelet Pipet 3 ul E. coli OP50, bu larvalar bir deney plakası üretmek için yeterince yaymak için en az 30 dakika bekleyin. Not: Standart tahlil plakaları üzerinde saf solucan pelet 3 ul> 3000 av larvalarını içerir. Bu saldırganları ve av arasındaki sık sık temas oluşturmak için yeterlidir. Gerekli ağız morph (protokol 1) için ekran yırtıcı nematodlar. Tahlil plakasına doğru sınıflandırılmış yırtıcı transferi, standart solucan toplama teknikleri ve hafif bir Stereomikroskopta kullanma 19. Bakteriyel kontaminasyonu minimize etmek için yırtıcı aktarırken tahlil plakasına mümkün olduğu kadar az OP50 bakteri aktarmak için özen gösterin. solucan transfer edilen stresinden kurtarmak ve solucanlar transferi hasar görmemiş emin olmak için vahşi tip hareketli davranışları kontrol etmek için izin vermek için 15 dakika bekleyin. Not: P açlıktan gerek yoktur pacificus, onlar iyi bakteriler üzerine beslenen bile diğer nematod larvalarının yüksek verimli yırtıcıları gibi. İyileştikten sonra, 10 dakika boyunca hafif bir stereomikroskop kullanılarak yırtıcı izleyin. Bu cihaz ile, gözlemlemek ve bu tür yırtıcı hareketini kısıtlayarak predator ile karakterize, ısırma gibi farklı beslenme olayları karakterize; nerede tespit edilir av manikür bir açılış ile, öldürme; ve beslenme, av iç organlar (Şekil 2A, B ve Film 1) gözlemlenebilir tüketimi kategorize. eleme ve doğruluğunu sağlamak için 10 ayrı yırtıcı nematod en az gözlemleyerek tahlil tekrarlayın. 3. Corpse Testi Not: Ölü deneyler, saldırgan davranış, daha hızlı bir şekilde belirlenmesini kolaylaştırır. Büyümek ve standart NGM plakalar üzerinde nematod kültürleri korumak ve bakteriyel l yemE. kılçık E. coli OP50 19. Daha önce de belirtildiği tahlil plakaları (- 2,5 protokol 2.1) triplicates oluşturun. Gerekli ağız morph için ekran yırtıcı nematodlar gibi standart solucan toplama teknikleri ve her bir deney plakası için gerekli ağız morph ile hafif bir stereomikroskopta transferi 5 yırtıcı nematod kullanma protokolü 1'de nitelendirdi. 2 saat av ile birlikte yırtıcı bırakın. 2 saat ekran boşaltılmış cesetlerin (Şekil 2B ve C) varlığı açısından tahlil plaka sonra. solucan parçaları bağırsaklar sızıntı veya eksik dahil belirgin morfolojik kusurları ile birlikte hareketlilik olmaması ile cesetleri belirleyin. Yutak ve Diş Hareketi 4. Analizi Büyümek ve standart NGM plakalar üzerinde nematod kültürleri korumak ve E. bakteriyel çim beslemek E. coli OP50 19. Daha önce (- 2,5 protokol 2.1) belirtildiği gibi tahlil plakaları üretmek. Standart 6 cm iseNGM plakaları uygun bir alternatif olarak 2 ml NGM içeren küçük 35 mm petri kutularının kapağını kullanın, objektif ve mikroskop sahne arasında uymaz. Gerekli ağzı Morph için ekran yırtıcı nematod teknikleri çekme standart solucan ve hafif bir stereomikroskop kullanarak protokol 1'de tarif edildiği gibi, bir deney plakası için tek bir doğru sınıflandırılmış yırtıcı aktarın. solucan transfer edilen stresinden kurtarmak için izin vermek için 15 dakika bekleyin. Yüksek hızlı kamera (Filmler 2 ve 3) ile, 63X Normaski – 40 bir mikroskop yırtıcı hayvanlar gözlemleyin. en az 20 hayvanlarda 50 Hz'de kayıt faringeal pompalama ve 15 saniye boyunca diş hareketi, doğru kantifikasyon sağlamak. Tekrar bireysel pompa ve diş olayları saymak için istenen hızda film kaydedildi. Not: diş hareketi ağız açıklığı tespit edilebilir ve ancak ob ise Pompa, farenks ortasında bulunan korpus, görülmektedirdorsal dişinden görev yaptı.