Ensaiar comportamentos alimentares predadores em<em> Pristionchus</em> E outros nematóides

1. Boca forma fenotipagem Boca Formulário de Identificação em agarose Pads Nota: Para visualizar os morphs boca de nematóides, imobilizar os vermes com um tratamento anestésico suave em almofadas de agarose e observar como se segue. Crescer e manter culturas de nematóides, tais como P. pacificus em 6 cm de mídia crescimento de nemátodos padrão (NGM) placas e alimentos em um gramado de bactérias E. coli OP50 19. Adicione almofadas de agarose adicionando primeiro 0,06 g de agarose em 3 ml de H 2 O em um tubo de 15 ml para fazer uma solução de agarose a 3 ml de 2%. Este pode ser armazenado durante até um ano a 4 ° C. Misture e derreter a agarose cuidadosamente em um forno de microondas ou, alternativamente, use um bloco de calor colocado em> 88 ° C. Uma vez completamente derretido, adicionar 10 ul de uma solução de azida de sódio a 10% para a agarose e homogeneiza-se. CUIDADO: azida de sódio seco é reactivo e todas as formas são tóxicos. Utilizando uma mistura 1 mlmicropipeta, colocar uma gota de não menos do que 300 ul de azida de agarose a mistura líquida para o meio de uma lâmina de microscópio de vidro padrão. Antes de o agar arrefece, colocar rapidamente uma segunda lâmina de microscópio sobre o topo da gota de modo a achatar a agarose, que forma uma almofada após arrefecimento. Repita o procedimento para o maior número de almofadas como é exigido. Imediatamente antes da utilização, casca Além as lâminas de microscópio de vidro deslizando-os um do outro. Nota: Se as almofadas de agarose são preparados com muita antecedência eles podem ser excessivamente seco e pode danificar os nematóides. Para transferir vermes para as almofadas de agarose anestésicos, colocar uma gota de tampão M9 (2-3 ul) para o centro da almofada. Escolha 2-3 jovem P. adultos pacificus para a gota de M9, antes de colocar uma lamela com cuidado sobre a almofada. O P. nemátodos pacificus será imobilizado em agarose e pronto para visualizar. Transferir a lâmina de microscópio contendo o worm anestesiado para um microscópio de uma adequadand observar sob 63X Nomarski óptica. Categorizar identidades morfo com base nas seguintes características: a presença de uma sub-ventral dente adicional, dente dorsal alargada e abertura de boca larga é indicativo de um animal Morph boca eurystomatous, enquanto que a presença de um único dente dorsal e abertura de boca estreita indica um stenostomatous animais (Figura 1). Nota: A fim de manter a saúde do animal, vermes deve ser mantida na almofada de ágar de não mais do que 5 minutos. Depois boca identificação de metamorfose, recuperar nematóides quer eurystomatous ou stenostomatous conforme exigido pela remoção da tampa de deslizamento, deslizando-o do bloco de agarose. Cuidadosamente pegar os animais selecionados a partir do bloco de agarose (E. coli OP50 pode ser usado na seleção para ajudar a tornar mais rígidas) em placas NGM frescos. Permitir a recuperação da anestesia até o comportamento motile normal foi retomado em que os animais estão prontos para mais ensaios predatórias. <li> rápida Boca fenotipagem Nota: Como alternativa, com mais experiência, boca tipo de formulário pode ser analisada sem a necessidade de qualquer tratamento anestésico através de um microscópio estereoscópico com ampliação elevada (150X). Nematóides colocam placas NGM padrão com um gramado bacteriana de E. coli OP50 na área de visualização do microscópio. Detectar diferenças no tamanho da boca e largura. Nota: Neste ampliação sem o dente como estruturas são observáveis, portanto, a identificação de metamorfose boca está baseada exclusivamente no largas bocas contra bocas estreitas. Ensaio 2. mordida Nota: Os ensaios Morder permitir uma análise comportamental predatória detalhado. Crescer e manter culturas de nematóides em placas NGM padrão (6 cm) e se alimentam de um gramado de bactérias E. coli OP50 19. Fazer placas de ensaio por crescimento de uma grande quantidade de larvas de nemátodos presa seleccionado, tal como C. elegans ou alternatively uma presa ecologicamente relevantes apropriado. Nota: Adulto C. elegans são demasiado grandes para ser presa adequada de modo que é importante usar a fase larvar. Manter C. elegans ou outras espécies de presas potenciais em placas NGM padrão e alimentos em um gramado de bactérias E. coli OP50 até que a população é preparado na fome, resultante em uma abundância de larvas L1 jovem. Nota: Tempo de inanição é dependente de numerosos factores ambientais e experimentais, incluindo o número de nemátodos utilizados para iniciar a cultura, a quantidade de E. coli OP50 adicionado, e a temperatura ambiente. Lavar quatro ou mais placas presas recém-esfomeados com M9 e passar a solução verme através de dois filtros de 20 fim de remover todos os animais de grande porte e todos os ovos restantes antes da coleta em um tubo de 15 ml. Apenas um pequeno larvas devem permanecer na solução. Para formar um sedimento das larvas centrifugar a presa filtrado a 377 xg durante 1 min. <li> Pipeta 3 ul de pellet verme pura em uma placa NGM seis centímetros sem E. coli OP50 presente e esperar pelo menos 30 minutos para as larvas para se espalhar o suficiente para gerar uma placa de ensaio. Nota: 3 ul de pellet verme pura nas placas de ensaio padrão contêm> 3.000 larvas presa. Isto é suficiente para gerar contactos frequentes entre predadores e presas. Tela nematóides predadores para a metamorfose boca exigida (protocolo 1). Usando vermes escolhendo técnicas padrão e um microscópio estereoscópico luz 19, transferir predadores corretamente classificados para a placa de ensaio. Tome cuidado para transferir como pequenas bactérias OP50 quanto possível para a placa de ensaio quando a transferência de predadores, a fim de minimizar a contaminação bacteriana. Aguarde 15 minutos para permitir que o worm para se recuperar do estresse de ser transferida e verificar o comportamento móveis do tipo selvagem para garantir vermes não foram danificados a partir da transferência. Nota: Não há necessidade de passar fome P. pacificus, como eles são predadores altamente eficientes de outras larvas de nematóides, mesmo quando bem alimentadas mediante bactérias. Após a recuperação, observar o predador usando um microscópio estereoscópico luz por 10 min. Com este equipamento, observar e caracterizar eventos de alimentação distintas, como morder, caracterizado pelo predador restringir o movimento da presa, matando, onde por uma abertura da cutícula presa é detectado; e alimentação, categorizados por um consumo observável das vísceras de presas (Figura 2A, B e Filme 1). Repetir o ensaio de rastreio e pela observação de um mínimo de 10 nemátodos predadores individuais para assegurar a precisão. Ensaio 3. Corpse Nota: Os ensaios Corpse facilitar uma quantificação mais rápida do comportamento predatório. Crescer e manter culturas de nematóides em placas NGM padrão e alimentam-se de um l bacterianaawn de E. coli OP50 19. Gerar triplicados das placas de ensaio mencionados anteriormente (protocolo 2,1-2,5). Tela nematóides predadores para a metamorfose boca exigida como descrito no protocolo 1. Usando vermes escolhendo técnicas padrão e uma transferência de luz microscópio estereoscópico 5 nematóides predadores com a metamorfose boca necessário para cada placa de ensaio. Deixar os predadores em conjunto com a presa durante 2 h. Após 2 h tela da placa de ensaio para a presença de corpos esvaziados (Figura 2B e C). Identificar cadáveres pela ausência de motilidade, juntamente com defeitos morfológicos óbvios, incluindo vazamento vísceras ou faltando fragmentos vermes. 4. Análise da faringe e movimentação dentária Crescer e manter culturas de nematóides em placas NGM padrão e alimentam-se de um gramado de bactérias E. coli OP50 19. Gerar placas de ensaio tal como mencionado anteriormente (protocolo de 2,1-2,5). Se padrão 6 cmplacas NGM não se encaixam entre o objetivo eo estágio do microscópio, utilize a tampa de pratos pequenos de 35 mm de petri contendo 2 ml NGM como uma alternativa adequada. Tela nematóides predadores para a metamorfose boca requeridos descritos no protocolo 1. Usando verme padrão escolhendo técnicas e uma lupa luz, transferir um único predador corretamente classificados para a placa de ensaio. Aguarde 15 minutos para permitir que o worm para se recuperar do estresse de ser transferido. Observar animais predadores em um microscópio a 40 – 63X Normaski, com uma câmera de alta velocidade (Filmes 2 e 3). Registro da faringe bombeamento e movimento dentário mais de 15 segundos, a 50 Hz em pelo menos 20 animais para garantir a quantificação precisa. Repetição de filmes gravados na velocidade desejada, a fim de contar com bombas individuais e eventos dente. Nota: O bombeamento é observado no corpus, localizado no meio da faringe, enquanto que o movimento do dente é detectável na abertura da boca e só é observido a partir do dente dorsal.