Het testen van Predatory Feeding gedrag in<em> Pristionchus</em> En andere Nematoden

1. Mouth vorm Phenotyping Mond Vorm Identification op Agarose Pads Let op: Met het oog op de nematode mond morphs visualiseren, immobiliseren de wormen met een milde verdoving behandeling op agarose pads en observeren als volgt. Groeien en te onderhouden nematode culturen zoals P. pacificus op 6 cm standaard nematode groei media (NGM) platen en voeden zich met een bacteriële grasveld van E. coli OP50 19. Maak agarose pads door eerst 0,06 g agarose tot 3 ml H 2 O in een buis van 15 ml tot 3 ml 2% agarose oplossing te maken. Dit kan worden bewaard tot een jaar bij 4 ° C Mix en smelt de agarose grondig in een magnetron of als alternatief gebruik maken van een warmte-blok ingesteld op> 88 ° C. Eenmaal volledig gesmolten is, voeg 10 ul van een 10% natrium- azide oplossing voor de agarose en meng. LET OP: Dry natriumazide reactief en alle vormen zijn giftig. Met behulp van een 1 mlmicropipet, een druppel van niet minder dan 300 pl van de vloeibare agarose mix azide op het midden van een standaard microscoopglaasje. Voor de agar afkoelt, wordt snel een tweede microscoopglaasje bovenop de drop om de agarose die een pad vormt bij afkoeling plat. Herhaal dit voor zoveel pads als nodig is. Vlak voor gebruik, schil elkaar het glas microscoopglaasjes door te schuiven ze uit elkaar. Let op: Als agarose pads te ver worden voorbereid op voorhand kunnen ze erg droog zijn en kan de aaltjes beschadigen. Wormen overdragen aan de narcose agarose pads, een druppel van M9 buffer (2-3 ui) op ​​het midden van het pad. Pick 2-3 jonge P. pacificus volwassenen in de daling van de M9 voor het plaatsen van een cover slip voorzichtig over het pad. De P. pacificus aaltjes worden geïmmobiliseerd in de agarose en klaar om te visualiseren. Breng de microscoop dia met de verdoofde worm aan een geschikte microscoop eennd observeren onder 63x Nomarski optiek. Categoriseren morph identiteiten op basis van de volgende kenmerken: de aanwezigheid van een extra sub-ventrale tand, vergroot dorsale tand en brede mond opening is indicatief voor een eurystomatous mond morph dier, terwijl de aanwezigheid van een enkele dorsale tand en smaller mondopening duidt op een stenostomatous dier (Figuur 1). Opmerking: Om de gezondheid van het dier te handhaven, moet wormen worden gehandhaafd overeenkomstig agarkussen niet langer dan 5 minuten. Na mond morph identificatie, herstellen ofwel eurystomatous of stenostomatous nematoden, zoals vereist door het verwijderen van het deksel slip door zachtjes te schuiven van de agarose pad. Pick zorgvuldig geselecteerde dieren uit de agarose pad (E. coli OP50 kan worden gebruikt op de pick te helpen maken stickier) op verse NGM platen. Laat het herstel van de narcose tot normaal beweeglijk gedrag heeft hervat, waarop de dieren zijn klaar voor verdere roofzuchtige assays. <li> Rapid Mouth Phenotyping Opmerking: Als alternatief meer ervaring mond vormtype kunnen worden getest zonder de noodzaak van verdoving behandeling via een stereomicroscoop met sterke vergroting (150X). Plaats nematoden op standaard NGM platen met een bacteriële grasveld van E. coli OP50 op de microscoop weergavegebied. Detecteren verschillen in de mond grootte en breedte. Let op: Op dit vergroting geen tand achtige structuren waarneembaar zijn daarom mond morph identificatie is uitsluitend gebaseerd op brede monden versus smalle mond. 2. Bite Assay Opmerking: Het bijten assays toestaan ​​dat een gedetailleerde roofzuchtige gedragsanalyse. Groeien en onderhouden nematode culturen op standaard NGM platen (6 cm) en voeden zich met een bacteriële grasveld van E. coli OP50 19. Voeg testplaten door kweken van een grote hoeveelheid geselecteerde prooien larven van nematoden zoals C. elegans of aldere kant een passende ecologisch relevante prooi. Opmerking: Adult C. elegans zijn te groot om geschikt prooi dus is het belangrijk om het larvale stadium gebruikt. Handhaaf C. elegans of andere potentiële prooi soorten op standaard NGM platen en voeden zich met een bacteriële grasveld van E. coli OP50 totdat de bevolking vers uitgehongerd, resulterend in een overvloed van jonge L1 larven. Opmerking: Tijd voor verhongering is afhankelijk van talrijke milieu en experimentele factoren, waaronder het aantal nematoden gebruikt om de kweek te starten, de hoeveelheid E. coli OP50 toegevoegd en de omgevingstemperatuur. Was vier of meer vers uitgehongerd prooi platen met M9 en laat de worm oplossing door middel van twee 20 urn filters om alle grote dieren en de resterende eieren voordat collectie te verwijderen in een 15 ml buis. Slechts kleine larven moeten in de oplossing blijven. Het vormen van een larvale pellet gecentrifugeerd gefiltreerd prooi bij 377 xg gedurende 1 min. <li> Pipetteer 3 pi van pure worm pellet op een 6 cm NGM plaat zonder E. coli OP50 aanwezig en wacht minstens 30 min voor larven uit voldoende verspreiden naar een testplaat te genereren. Opmerking: 3 pl pure worm pellet op de standaard assay platen bevatten> 3.000 prooi larven. Dit is voldoende om veelvuldig contact tussen roofdieren en prooien te genereren. Screen roofnematoden voor de gewenste mond morph (protocol 1). Met behulp van standaard worm plukken technieken en een lichte stereomicroscoop 19, transfer correct geclassificeerde roofdieren op de assay plaat. Zorg ervoor dat slechts OP50 bacteriën mogelijk toe aan de testplaat bij het overbrengen roofdieren om bacteriële besmetting te minimaliseren. Wacht 15 minuten om de worm te herstellen van de stress van wordt overgebracht en controleer op wild-type beweeglijke gedrag om ervoor te zorgen wormen niet zijn beschadigd door de overdracht. Opmerking: Er hoeft P. verhongeren pacificus, zoals ze zijn zeer efficiënte roofdieren van andere larven van nematoden zelfs terwijl goed gevoed op bacteriën. Na herstel, observeert de roofdier met behulp van een lichte stereomicroscoop gedurende 10 min. Met deze apparatuur, observeren en karakteriseren verschillende voeden evenementen, zoals bijten, gekenmerkt door het roofdier het beperken van de beweging van de prooi, doden, waarbij door een opening van de prooi cuticula wordt gedetecteerd; en voeding, gecategoriseerd door een waarneembare consumptie van de prooi ingewanden (Figuur 2A, B en Movie 1). Herhaal de test van screening en observeren van minimaal 10 individuele roofnematoden nauwkeurigheid te verzekeren. 3. Corpse Assay Opmerking: Corpse assays een snellere kwantificering van roofzuchtig marktgedrag te vergemakkelijken. Groeien en onderhouden nematode culturen op standaard NGM platen en voeden zich met een bacteriële lAWN van E. coli OP50 19. Genereer drie exemplaren van de genoemde assay platen (protocol 2,1-2,5). Screen roofnematoden voor de benodigde mond morph zoals beschreven in protocol 1. Met behulp van standaard worm plukken technieken en een lichte stereomicroscoop overdracht 5 roofnematoden met de vereiste mond morph aan elke assay plaat. Laat de roofdieren samen met de prooi voor 2 uur. Na 2 uur scherm de testplaat op de aanwezigheid van geleegd lijken (Figuur 2B en C). Identificeren van lichamen door de afwezigheid van beweeglijkheid, samen met duidelijke morfologische gebreken, waaronder lekken ingewanden of ontbrekende worm fragmenten. 4. Analyse van Pharyngeal en tandverplaatsing Groeien en onderhouden nematode culturen op standaard NGM platen en voeden zich met een bacteriële grasveld van E. coli OP50 19. Genereren testplaten zoals eerder (protocol 2,1-2,5) genoemd. Als standaard 6 cmNGM platen niet passen tussen het doel en de microscoop podium, gebruik maken van de deksel van de kleine 35 mm petrischaaltjes met 2 ml NGM als een geschikt alternatief. Screen roofnematoden voor de benodigde mond morph zoals beschreven in protocol 1. Met behulp van standaard worm plukken technieken en een lichte stereomicroscoop, overdragen één correct ingedeeld roofdier op de assay plaat. Wacht 15 minuten zodat de worm te herstellen van de stress worden overgedragen. Observeer roofzuchtige dieren op een microscoop bij 40 – 63x Normaski, met een high-speed camera (films 2 en 3). Record keelholte pompen en tand beweging over 15 sec, bij 50 Hz bij ten minste 20 dieren om nauwkeurige kwantificering te verzekeren. Replay opgenomen films op de gewenste snelheid om de individuele pompen en tand evenementen tellen. Noot: Pompen waargenomen in het corpus, gelegen in het midden van de keelholte, terwijl tandverplaatsing detecteerbaar in de mondopening en slechts obgeserveerd vanaf de dorsale tand.