זרימה מיון ו Exome רצף של תאים ריד סטרנברג של לימפומה קלאסית הודג'קין
Summary
כאן, אנו מתארים זרם תא cytometric תזרים מיון נמוך קלט, הדור הבא של ספריית פרוטוקול בנייה שנועד לייצר באיכות גבוהה, נתונים exome מלא של Hodgkin ריד- Sternberg (HRS) תאים של לימפומה הודגקין קלאסית (CHL).
Abstract
תאים Hodgkin Reed-Sternberg של לימפומה הודג 'קין קלאסית מופצים בדלילות ברקע של לימפוציטים דלקתיים בדרך כלל מהווים פחות מ 1% של מסת הגידול. חומר נגזר הגידול בתכולה מכיל תוכן הגידול על ריכוז מספיק לאפיון. לכן, פלואורסצנטי מופעלת תא מיון באמצעות שמונה נוגדנים, כמו גם בצד ופיזור קדימה, מתואר כאן כשיטה של הפרדה במהירות וריכוז עם אלפי טוהר גבוה של תאים HRS מן הגידול למחקר הבא. במקביל, בגלל פרוטוקולים סטנדרטיים עבור רצף exome בדרך כלל דורשים 100-1,000 ng של קלט DNA, אשר לעתים קרובות גבוה מדי, אפילו עם מיון זרימה, אנו מספקים גם אופטימיזציה, נמוך קלט ספריה פרוטוקול מסוגל לייצר באיכות גבוהה נתונים של פחות מ 10 ng של קלט DNA. שילוב זה מסוגל לייצר את הדור הבא ספריות מתאים ללכידת הכלאה של כל eXome baits או ממוקד יותר ממוקד לוחות, לפי הצורך. Exome רצף של תאים HRS, כאשר לעומת intratumor בריאים T או B תאים, יכול לזהות שינויים סומטיים, כולל מוטציות, הוספות ומחיקות, ושינויים מספר עותק. ממצאים אלה מבהירים את הביולוגיה המולקולרית של תאי ה- HRS ועשויים לחשוף אפיקים לטיפולים ממוקדים.
Introduction
התקדמות בגנום הסרטן כתוצאה מרצף הדור הבא הובילה לפריצות דרך משמעותיות בזיהוי מטרות טיפוליות ובפרוגנוזה עבור גידולים המטולוגיים ולא המטולוגיים רבים. אסטרטגיות טיפול ייחודיות חדשות, המבוססות על שינויים גנומיים ספציפיים, מועברות במהירות לסוגים רבים של גידולים (נבדקו בהמלצות 1 , 2 ). למרות התקדמות משמעותית בגנומיקה הלימפומה, הגנום של תאי ה- HRS הניאופלסטיים בלימפומה קלאסית של הודג'קין (CHL) לא אובחן. החקירות כבר הקשו על ידי מחסור של תאים ניאופלסטיים HRS בתוך microenvironment תגובתי, מה שהופך אותו קשה לבודד מטוהרים אוכלוסיות תאים HRS 3 .
השיטה לבידוד תאי HRS בת קיימא מגידולים ראשוניים פותחה על ידי פרום ואחרים. 4 ,5 , 6. השיטה משתמשת בקוקטייל של שמונה נוגדן, המורכב מתקליטורים מסוג CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 ו- CD64, כדי לזהות באופן חד משמעי תאי HRS מתליית גידול של CHL. מסוגלים לבודד לפחות 1,000 תאים בת קיימא HRS מן המתלים טריים או קפואים התא מ ביופסיות הגידול המורכב של לפחות 10 7 תאים (כ 10 מ"ג של רקמה) .הטוהר הוא גדול מ -90% על ידי זרימת cytometric זרימה מוערך להיות לפחות 80% על ידי ניתוח גנומי exome של עשרה מקרים רצופים.
יש לנו מעודן הזרימה cytometric תא בידוד טכניקה כי יש להקל מאוד את התהליך, המאפשר בידוד מהיר של אלפי תאים HRS קיימא של גידולי CHL העיקרי 7 . השתמשנו בטכניקה כדי לייצר את מה שהוא האמין להיות רצף שלם הראשון exome של תאים סרטניים במקרים העיקריים של לימפומה הודג'קין. המחקרים שלנו מדגימיםE היתכנות של תפוקה גבוהה, גנום רחב מחקרים של מקרים CHL הפרט כבר הובילו לזיהוי של שינויים גנומי חדש עם פוטנציאל להסביר היבטים של פתוגנזה CHL.
אנחנו עוד פיתחה צינור כדי לנצל את ה- DNA שחולצו עבור תפוקה גבוהה מחקרים גנומיים. על מנת להשיג תוצאות אמינות מעטים כמו 1,000 תאים HRS מיון (מינימום המתקבל מקרים רציף), אנו עוד פיתחו שינוי הדור הבא של דנ"א בניית הספרייה 8 שאיפשר לנו להגדיל את קשירת קשירת יעילות וליצור ספריות שבר DNA ללא הגברה מופרזת. שיטה זו מאפשרת ניתוח של דגימות קליניות שגרתיות וזיהוי של מוטציות חוזרות ושינויים כרומוזומליים 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
יישומים עתידיים או כיוונים לאחר מאסטרינג טכניקה זו
עבודה זו מאפשרת exome רצף מדגמים המכילים לפחות 10 ng של DNA. בהקשר הקליני, מגבלה זו אינה כוללת את רוב הדגימות של שאיבת המחט, בשל חומר לא מספיק, אך היא כוללת ביופסיות ליבה נאותות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפיתוח של שיטה זו הפרויקט מומן על ידי המחלקה לפתולוגיה ו רפואה מעבדה של וייל קורנל המכללה הרפואית. אנו מכירים בתכנית ההכשרה המוסדית המשולבת בביולוגיה חישובית וברפואה למימון חלקי. ברצוננו להודות למדענים שחלקו עמם את זמנם ואת הידע שלהם, בייחוד את מריקה אפל; דן ברג'ס; Iwanka Kozarewa; צ'אד לוקלייר; וכולם מתוך מכללת וייל קורנל מכללת גנומיקס הליבה, כולל ג 'ני ג' אנג, Xiaobo (שון) ליאנג, דונג שו, ווי ג 'אנג, Huimin שאנג, טטיאנה בטסון, ו טאו ז' אנג.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
References
- Abrams, J. National Cancer Institute’s Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80 (2015).
- Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
- Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
- Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
- Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034 (2011).
- Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
- Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617 (2012).
- Brunicardi, F. C. . Schwartz’s Principles of Surgery. , (2014).
- Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, (1996).
- Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin’s cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
- Biosciences. . FACSAria II User’s Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
- . Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216 Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017)
- Roche Nimblegen. . SeqCap EZ Library SR User’s Guide ver. 4.1. , (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
- Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- . DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0 Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013)
