محاكاة وظيفة من البروتينات اشارة: نحو الاصطناعي الإشارة العلاج تنبيغ
Summary
We present guidelines for developing synthetic ‘chemical transducers’ that can induce communication between naturally unrelated proteins. In addition, detailed protocols are presented for synthesizing and testing a specific ‘transducer’ that enables a growth factor to activate a detoxifying enzyme and consequently, to regulate the cleavage of an anticancer prodrug.
Abstract
Signal transduction pathways, which control the response of cells to various environmental signals, are mediated by the function of signaling proteins that interact with each other and activate one other with high specificity. Synthetic agents that mimic the function of these proteins might therefore be used to generate unnatural signal transduction steps and consequently, alter the cell’s function. We present guidelines for designing ‘chemical transducers’ that can induce artificial communication between native proteins. In addition, we present detailed protocols for synthesizing and testing a specific ‘transducer’, which can induce communication between two unrelated proteins: platelet-derived growth-factor (PDGF) and glutathione-S-transferase (GST). The way by which this unnatural PDGF-GST communication could be used to control the cleavage of an anticancer prodrug is also presented, indicating the potential for using such systems in ‘artificial signal transduction therapy’. This work is intended to facilitate developing additional ‘transducers’ of this class, which may be used to mediate intracellular protein-protein communication and consequently, to induce artificial cell signaling pathways.
Introduction
مسارات نقل الإشارة تلعب دورا هاما في عملية الخلوية تقريبا كل وتسمح للخلية للرد السريع للإشارات البيئية. 1 وغالبا ما تسبب هذه الممرات من قبل ملزم لجزيء إشارة إلى مستقبلات الخلية، مما يؤدي إلى تنشيط الانزيمات داخل الخلايا. وتوسط التضخيم ونشر هذا إشارة داخل الخلية عن طريق وظيفة يشير البروتينات التي تشكل شبكة من التفاعلات البروتين البروتين الذي الانزيمات يتم تنشيط عكسية مع خصوصية عالية. بسبب التقلبات من هذه الشبكات في كثير من الأحيان يؤدي إلى تطور مرض السرطان، وكان هناك الكثير من الاهتمام في إنشاء "إشارة العلاج تنبيغ السرطان، 2 حيث تم تصميم عقاقير لتعطيل مسارات الإشارات الخبيثة. لقد اقترحت مؤخرا نهجا بديلا للإشارة إلى العلاج التنبيغ التي تعتمد على قدرة الأدوية لتوليد غير طبيعية مسارات نقل الإشارة. <suP> 3 على وجه الخصوص، ونحن نعتقد أن من خلال تصميم وكلاء الاصطناعية التي تحاكي وظيفة من البروتينات مما يشير إلى أنه سيكون من الممكن لتعديل وظيفة الخلية بشكل غير مباشر. على سبيل المثال، قد تكون هذه الشبكات الاصطناعية تمكن المؤشرات الحيوية البروتين لتنشيط الانزيمات التي يلتصق طلائع الأدوية. بدلا من ذلك، قد تكون هذه محاكيات البروتين يشير قادرة على تنشيط مسارات غير طبيعية خلية الإشارات، مما أدى إلى الآثار العلاجية.
للتدليل على جدوى هذا النهج، وقد انشأنا مؤخرا الاصطناعية "محول الكيميائي" 4 التي تمكن عامل النمو المشتق من الصفيحات (PDGF) لتحريك الانقسام من دواء مساعد المضادة للسرطان من خلال تفعيل الجلوتاثيون-ق-ترانسفيراز (GST)، وهو لا شريك ملزم الطبيعي. هيكل هذا "محول" يتكون من مضاد PDGF-أبتمر الحمض النووي التي تم تعديلها مع مثبط ثنائي التكافؤ لضريبة السلع والخدمات. وبالتالي، فإن هذا عامل الاصطناعية ينتمي إلى عائلة من الجزيئات مع مواقع الربط لالبروتينات المختلفة، مثل 5-7 محرضات الكيميائية من dimerization (رقم تعريفي للعملاء) 10/08، وكذلك إلى مجموعة البروتينات والمواد اللاصقة على أساس تقارن جزيء النوكليوتيد الاصطناعية. 11-21
المبادئ العامة التي يقوم عليها تصميم هذه النظم يوصف هنا ووتقدم بروتوكولات مفصلة لتجميع واختبار وظيفة هذا "محول" مع المقايسات الأنزيمية التقليدية. ويهدف هذا العمل إلى تسهيل النامية محولات "إضافية من هذه الفئة، والتي يمكن استخدامها للتوسط بين الخلايا الاتصالات البروتين البروتين، وبالتالي، للحث الاصطناعية مسارات الخلية إشارات.
الشكل 1 يصف الخطوط العريضة لمبادئ التشغيل من "محولات الكيماوية الاصطناعية التي يمكن أن توسط غير طبيعية الاتصالات البروتين البروتين. في هذا التوضيح، وهو 'محول الكيميائية "، الذي يجمع بين المجلدات الاصطناعية لبروتتمكن EINS الأول والثاني (المجلدات الأول والثاني)، والبروتين الثاني لتحريك النشاط التحفيزي من البروتين الأول، الذي لا شريك له ملزم الطبيعي. في غياب البروتين الثاني، محول يربط الموقع الحفاز للانزيم (البروتين الأول) ويمنع نشاطها (الشكل 1، الدولة الثانية). الربط من "محول" لبروتين الثاني، ومع ذلك، يعزز التفاعل بين الموثق الأول وسطح البروتين الثاني (الشكل 1، دولة ج)، مما يقلل من تقارب تجاه بروتين أولا ونتيجة لذلك، فإن التركيز الفعال لل" يتم تقليل الحرة 'محول في الحل، الأمر الذي يؤدي إلى تفكك محول البروتين أنا معقد وتنشيط بروتين الأول (الشكل 1، الدولة رابعا). معا، وتبرز هذه الخطوات الثلاث المبادئ الأساسية التي يقوم عليها تصميم "محولات" فعالة: (1) "محول" يجب أن يكون الموثق محددة لكل من الأهداف البروتين، (2) betwe التفاعلأون الموثق الثاني والبروتين يجب أن يكون الثاني أقوى من التفاعل بين الموثق الأول والبروتين الأول، و (3) الموثق يجب أن تكون قادرة على التفاعل مع سطح البروتين الثاني. هذا المبدأ الأخير لا يتطلب بالضرورة أن الموثق أنا وحدي سيكون له قابلية عالية والانتقائية تجاه بروتين الثاني. بدلا من ذلك، لأنه يقوم على دراساتنا الأخيرة التي أظهرت أن جلب جزيء اصطناعي على مقربة من البروتين من المرجح أن تعزيز التفاعل بين هذا الجزيء وسطح البروتين. 19،22،23
الشكل 1: التشغيل مبادئ "محولات الطاقة الكيميائية" عندما يتم إضافة "محول الكيميائية" إلى البروتين النشط أنا (ولاية ط)، فإنه يلزم لموقعها النشط من خلال الموثق الأول ويمنع نشاطها (ولاية ب). في وجود البروتين الثاني، ومع ذلك، فإن غير منضم 'ر الكيميائيةransducer "يتفاعل مع البروتين الثاني عن طريق الموثق الثاني، الذي يعزز التفاعل بين الموثق الأول وسطح البروتين الثاني. هذا الموثق يسببها I-بروتين الثاني التفاعل يقلل من التركيز الفعال من الموثق الأول، الأمر الذي يؤدي إلى التفكك من 'transducer' البروتين أنا مجمع والبروتين أنا تنشيط (ولاية الرابع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .
Protocol
Representative Results
Discussion
We presented a method for designing and testing of a ‘chemical transducer’ that can induce artificial communication between two naturally unrelated proteins, GST and PDGF, without modifying the native proteins. The unnatural GST-PDGF communications could be detected in real time by using enzymatic assays that follow the changes in the activity of GST in the presence of the ‘chemical transducer’ and increasing the concentrations of PDGF. In addition to detecting the activation of GST by PDGF, these assays were used to fol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة منيرفا، ومنظمة HFSP، ومجلس بحوث غرانت الأوروبي (بدءا جرانت 338265).
Materials
| 1-chloro-2,4-dinitrobenzene | Sigma-Aldrich | 237329 | |
| Acetic acid | Bio Lab | 01070521 | |
| Acetnitrile | J.T.Baker | 9017-03 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Copper(II) Sulfate pentahydrate | Merck-Millipore | 102790 | |
| Dimethyl sulfoxide | Merck-Millipore | 802912 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Biological Industries | 02-023-5A | |
| Ethacrynic acid | Tokyo Chemical Industry Co. Ltd | E0526 | |
| Glutathione-s-transferase M1-1 | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) | ||
| JS-K | Sigma-Aldrich | J4137 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| Magnesium Chloride | J.T.Baker | 0162 | |
| nitrate/nitrite colorimetric assay kit | Cayman Chemical | 780001 | |
| Oligonucleotides | W. M. Keck Foundation Biotechnology at Yale University | custom order | |
| PDGF-BB | Israel Structural Proteomics Center (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel) | ||
| TBTA | Sigma-Aldrich | 678937 | |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | |
| Desalting column | GE Healthcare | illustra MicroSpin G-25 Columns | |
| HPLC | Waters | 2695 separation module | |
| HPLC column | Waters | XBridgeTM OST C18 column (2.5 μM, 4.6 mm × 50 mm) | |
| HPLC column | Waters | XBridgeTM OST C18 column (2.5μM, 10 mm × 50 mm) | |
| Plate reader | BioTek | synergy H4 hybrid |
References
- Hunter, T. Signaling—2000 and Beyond. Cell. 100, 113-127 (2000).
- Levitzki, A., Klein, S. Signal transduction therapy of cancer. Mol Aspects Med. 31, 287-329 (2010).
- Peri-Naor, R., Motiei, L., Margulies, D. Artificial signal transduction therapy: a futuristic approach to disease treatment. Future Med. Chem. 7, 2091-2093 (2015).
- Peri-Naor, R., Ilani, T., Motiei, L., Margulies, D. Protein-Protein Communication and Enzyme Activation Mediated by a Synthetic Chemical Transducer. J. Am. Chem. Soc. 137, 9507-9510 (2015).
- Corson, T. W., Aberle, N., Crews, C. M. Design and Applications of Bifunctional Small Molecules: Why Two Heads Are Better Than One. ACS Chem. Biol. 3, 677-692 (2008).
- Rutkowska, A., Schultz, C. Protein Tango: The Toolbox to Capture Interacting Partners. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8166-8176 (2012).
- Meyer, C., Köhn, M. A Molecular Tête-à-Tête Arranged by a Designed Adaptor Protein. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 8160-8162 (2012).
- Klemm, J. D., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimerization as a Regulatory Mechanism in Signal Transduction. Annu. Rev. Immunol. 16, 569-592 (1998).
- DeRose, R., Miyamoto, T., Inoue, T. Manipulating signaling at will: chemically-inducible dimerization (CID) techniques resolve problems in cell biology. Pflugers Arch. 465, 409-417 (2013).
- Gestwicki, J. E., Marinec, P. S. Chemical control over protein-protein interactions: beyond inhibitors. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 10, 667-675 (2007).
- Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. 25, 848-862 (2013).
- Diezmann, F., Seitz, O. DNA-guided display of proteins and protein ligands for the interrogation of biology. Chem. Soc. Rev. 40, 5789-5801 (2011).
- Röglin, L., Ahmadian, M. R., Seitz, O. DNA-Controlled Reversible Switching of Peptide Conformation and Bioactivity. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2704-2707 (2007).
- Röglin, L., Altenbrunn, F., Seitz, O. DNA and RNA-Controlled Switching of Protein Kinase Activity. ChemBioChem. 10, 758-765 (2009).
- Harris, D. C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. DNA-Small Molecule Chimera with Responsive Protein-Binding Ability. J. Am. Chem. Soc. 130, 14950-14951 (2008).
- Harris, D. C., Saks, B. R., Jayawickramarajah, J. Protein-Binding Molecular Switches via Host-Guest Stabilized DNA Hairpins. J. Am. Chem. Soc. 133, 7676-7679 (2011).
- Kim, Y., Cao, Z., Tan, W. Molecular assembly for high-performance bivalent nucleic acid inhibitor. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5664-5669 (2008).
- Han, D., et al. A Logical Molecular Circuit for Programmable and Autonomous Regulation of Protein Activity Using DNA Aptamer-Protein Interactions. J. Am. Chem. Soc. 134, 20797-20804 (2012).
- Motiei, L., Pode, Z., Koganitsky, A., Margulies, D. Targeted Protein Surface Sensors as a Tool for Analyzing Small Populations of Proteins in Biological Mixtures. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 9289-9293 (2014).
- Ranallo, S., Rossetti, M., Plaxco, K. W., Vallée-Bélisle, A., Ricci, F. A Modular, DNA-Based Beacon for Single-Step Fluorescence Detection of Antibodies and Other Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 13214-13218 (2015).
- Franzini, R. M., et al. Identification of Structure-Activity Relationships from Screening a Structurally Compact DNA-Encoded Chemical Library. Angew. Chem. Int. Ed. 54, 3927-3931 (2015).
- Unger-Angel, L., et al. Protein recognition by bivalent, ‘turn-on’ fluorescent molecular probes. Chem. Sci. 6, 5419-5425 (2015).
- Nissinkorn, Y., et al. Sensing Protein Surfaces with Targeted Fluorescent Receptors. Chem. Eur. J. 21, 15981-15987 (2015).
- Huber, C. G., Oefner, P. J., Bonn, G. K. High-Resolution Liquid Chromatography of Oligonucleotides on Nonporous Alkylated Styrene-Divinylbenzene Copolymers. Anal. Biochem. 212, 351-358 (1993).
- Lyon, R. P., Hill, J. J., Atkins, W. M. Novel class of bivalent glutathione S-transferase inhibitors. Biochemistry. 42, 10418-10428 (2003).
- Battle, C., Chu, X., Jayawickramarajah, J. Oligonucleotide-based systems for input-controlled and non-covalently regulated protein binding. Supramol. Chem. , 1-16 (2013).
