Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
Transkripsiyon sonrası gen tam olarak çekirdeğin DNA transkripsiyonu ile başlayan, düzenlenir. RNA proteinleri (RBPS) bağlayıcı tarafından kontrol mRNA biogenesis ve metabolizma RNA metabolizması 1-3 ilerlemesi sırasında bir alt tabaka öncüsü mRNA ile ayırmak doçent ve son derece dinamik Ribonükleoprotein parçacıklar (RNP), ortaya çıkar. RNP bileşenleri dinamik değişiklikler mRNA transkripsiyon sonrası kaderini etkileyen ve primer transkript, nükleer kaçakçılığı ve lokalizasyonu, çeviri için mRNA şablon olarak kendi faaliyet ve olgun mRNA nihai ciro işlenmesi sırasında kalite güvence sağlamak.
Çok sayıda protein RNA tanıma motifinin (RRM) dahil olmak üzere korunmuş amino asit etki, sayesinde RBPS olarak tanımlanır, çift kollu bir RNA bağlama alanı (RDB) ve temel artıklarının kısımlarının (örneğin, arginin, lizin, glisin) 4. RBPS rutin vardırimmünopresipitasyon stratejileri ile izole ve soydaş RNA'lar belirlemek için taranmaktadır. Bazı RBPS RNA regulonlarının 5-8 olarak tanımlanan fonksiyonel ilişkili olan önceden mRNA eş düzenler. Bu RBPS kendi aynı kökenli mRNA'lar, ve bazen de kodlayıcı olmayan RNA bileşim içinde değişebilir katalitik RNP oluşturur; kendi benzersiz bağlı ilişkili faktörler, çeşitli kombinasyonları, aynı zamanda bunların etkileşimleri 9 zamansal dizisi, yer ve süresi için.
RNA immünopresipitasyon (RIP) hücrelerden RNP izole etmek ve sekans analizi 10-13 kullanarak ilişkili transkript tanımlamak için güçlü bir tekniktir. Aday hareketle genom çapında için tarama bir mikro-dizi analizi 14 ya da yüksek verimlilik sıralaması (RNAseq) 15 ile kombine RIP ile mümkündür. Bunlar, birlikte-çökeltme antikor 16 yeterince zengindirler ve ayrılabilir Aynı şekilde, birlikte-çökeltme proteinler, kütle spektrometresi ile tespit edilebilir,17. yaklaşım, bitki hücreleri, mantar, virüs ve bakteri çözünebilir lizatları olarak değişebilir, ancak Burada, kültürlenmiş insan hücrelerinden belirli bir aynı kökenli RNA RNP bileşenlerini izole etmek için bir yöntem arayabilir. Şekil 1 'de özetlendiği gibi, malzemenin aşağı akış analiz, aday belirlenmesi ve kabul immunoblotting, kütle spektrometrisi, biyokimyasal enzimatik tahlil, RT-qPCR, mikrodizi ve RNAseq bulunmaktadır.
Transkripsiyon sonrası seviyede gene ekspresyonunu kontrol etmede RNP temel rolü göz önüne alındığında, bileşen RBPS veya erişilebilirlik ekspresyonunda değişiklikler RNA'lar hücre için zararlı olabilir ve nörolojik hastalıkları 18 de dahil olmak üzere hastalıkların çeşitli türleri ile ilişkilidir, aynı soydan gelen. DHX9 / RNA helikaz A (RHA), hücresel ve retroviral kökenli 6 seçilmiş mRNA'ların çevrilmesinin için gereklidir. Bu aynı kökenli RNA'lar olan yapısal olarak ilgili, cis etkili elemanlar sergileyen kendiTranskripsiyon sonrası kontrol elemanının (PCE) 19 olarak belirlenmiş 5 'UTR,. RHA-PCE aktivitesi, HIV-1 de dahil olmak üzere pek çok retrovirüsler, etkin kap bağımlı çeviri için gerekli olan ve JUND 6,20,21, büyüme düzenleyici genlerin. Önemli bir gen (dhx9) tarafından kodlanır, RHA hücre çoğalması ve düşük-regülasyona karşı gerekli hücre canlılığı 22 ortadan kaldırır. RHA-PCE RNP moleküler analiz RHA-PCE etkinliği hücre çoğalmasını kontrol etmek için neden gerekli olduğunu anlamak için önemli bir adımdır.
Kararlı durumda ya da hücrenin fizyolojik pertürbasyon üzerine RHA-PCE RNP bileşenlerinin hassas karakterizasyonu aşağı analiz için yeterli bolluk içinde RHA-PCE RNP seçici zenginleştirme ve yakalama gerektirir. Burada, retroviral PCEgag RNA açık okuma çerçevesinde MS2 kaplama proteininin (CP) için sis etkili RNA bağlanma sitenin 6 kopya ile etiketlenmiş. MS2 kılıf proteini ekzo edildigenously birlikte ifade plazmid transfeksiyon ile PCEgag RNA ile büyüyen hücrelerde RNP Montajı kolaylaştırmak için. Aynı kökenli MS2-etiketli PCEgag RNA MS2 kaplama proteini içeren RNP hücre özütü immunoprecipitatesi manyetik boncuk (Şekil 2a) üzerinde alınmıştır. seçici PCE bağlı RNP bileşenleri elde etmek için, immobilize RNP RNase H aktivitesi için alt-tabaka olan bir RNA-DNA melezi oluşturan PCE distal dizilerine tamamlayıcı olan bir oligonükleotid ile inkübe edildi. PCE çevrilmemiş bölge 5 '5' ucu 'konumlandırılmış olduğundan, oligonükleotid retroviral başlangıç sitesine (gag start kodonu) bitişik RNA dizilerine tamamlayıcı. yıkama sıvısı olarak toplandı immobilize RNP, serbest 5 'UTR kompleksi kodon gag başlangıcına yakın RNaz H bölünme. Daha sonra, örnek captu onaylamak için PCEgag ve SDS PAGE ve immunoblot yakalamayı teyit etmek için RT-PCR ile değerlendirildiHedef MS2 kılıf proteini yeniden. PCE ilişkili RNA bağlayıcı proteinin doğrulama DHX9 / RNA helikaz A, sonra gerçekleştirildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan RNP izolasyon ve aynı kökenli RNA tespiti stratejisi belirli bir RNA-protein etkileşimini inceleyen ve eş düzenleyen aday proteinleri keşfetmek hücreler belirli bir RNP seçici bir araçtır.
RNP izole yapmak için oligonükleotid yönlendirilmiş RNase H ile bölünmesini kullanmanın avantajı yakalamak ve özellikle ilgi cis-hareket eden RNA elemanına aşağı bağlanmış heterojen RNP fazla RNP cis-hareket eden RNA eleman analizi yeteneğidir. Belirli bir RNP …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle NIH P50GM103297, P30CA100730 ve Kapsamlı Kanser P01CA16058 tarafından destek için minnettarım.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
