Summary

Выделение родственным РНК-белковых комплексов из клеток с использованием направленного на олигонуклеотиды элюция

Published: January 16, 2017
doi:

Summary

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Abstract

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.

The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

Introduction

Выражение посттранскрипционных ген точно регулируется, начиная с транскрипции ДНК в ядре. Контролируется РНК – связывающие белки (ОДП), мРНК биогенеза и метаболизм происходят в очень динамичных частиц рибонуклеопротеидных (РНП), которые ассоциируются и диссоциируют с мРНК предшественника субстрата при прогрессировании метаболизма РНК 1-3. Динамические изменения в компонентах RNP влияют на пост-транскрипционный судьбу мРНК и обеспечения контроля качества при обработке первичных транскриптов, их оборота ядерных материалов и локализации, их деятельности в качестве шаблонов мРНК для перевода, и в конечном итоге оборот зрелых мРНК.

Многочисленные белки обозначены как ОДП в силу своих консервативных областей аминокислот, в том числе мотив распознавания РНК (RRM), двухцепочечной РНК – связывающий домен (РДО), и вытягивание основных остатков (например, аргинин, лизин, и глицин) 4. ОДП обычноизолированных стратегиями иммунопреципитационных и просеивают, чтобы идентифицировать их родственными РНК. Некоторые ОДП совместно регулируют пре-мРНК, функционально связанные, обозначенные как РНК регулонов 5-8. Эти ОДП, их родственными мРНК, а иногда и некодирующих РНК, образуют каталитические РНП, которые различаются по составу; их уникальность обусловлена различными комбинациями сопутствующих факторов, а также временной последовательности, расположения, и продолжительность их взаимодействий 9.

РНК иммунопреципитации (RIP) является мощным средством , чтобы изолировать РНП из клеток и выявления сопутствующих транскриптов с помощью анализа последовательности 10-13. Переход от кандидата к геному скрининг возможна через RIP в сочетании с микрочипов анализа 14 или высокой пропускной последовательности (Секвенирование РНК) 15. Точно так же, соосаждение белки могут быть идентифицированы с помощью масс – спектрометрии, если они достаточно обильны и отделим от совместным осаждением антителом 16,17. Здесь мы рассматриваем методику выделения RNP компонентов определенной родственным РНК из культивируемых клетках человека, хотя подход изменяемыми для растворимых лизатов клеток растений, грибов, вирусов и бактерий. Downstream анализ материала включают идентификацию кандидатов и проверку с помощью иммуноблот, масс – спектрометрии, биохимический анализ ферментативной, RT-КПЦР, микрочипов и Секвенирование РНК, как представлено на рисунке 1.

Учитывая фундаментальную роль RNPs в контроле экспрессии генов на пост-транскрипционном уровне, изменения в экспрессии компонентов ОДП или их доступности к родственным РНК может быть вредно для клетки и связаны с несколькими типами расстройств, включая неврологические заболевания 18. DHX9 / РНК хеликаза А (РГА) необходимо для перевода отдельных мРНК клеточных и ретровирусных происхождения 6. Эти родственными РНК обладают структурно-родственные элементы цис-действующие в рамках своих5 'UTR, который обозначается как пост-транскрипционном управляющего элемента (PCE) 19. РГА-PCE активность необходима для эффективной кэп-зависимой трансляции многих ретровирусов, в том числе ВИЧ-1, а также гены , регулирующие рост, в том числе Джунд 6,20,21. Кодируемый геном (эссенциальной dhx9), РГА имеет важное значение для клеточной пролиферации и его понижающей регуляции исключает жизнеспособность 22 клеток. Молекулярный анализ RHA-PCE РНП является важным шагом на пути к пониманию того, почему РГА-PCE деятельность необходимо контролировать клеточную пролиферацию.

Точная характеристика компонентов RNP РГА-PCE в стационарном состоянии или при физиологической возмущения клетки требует селективного обогащения и захвата из РГА-PCE RNPs в достаточном изобилии для анализа вниз по течению. Здесь, ретровирусный РНК PCEgag был помечен 6 копий сайта цис-связывания РНК для белка оболочки MS2 (СР) в пределах открытой рамки считывания. Белок оболочки MS2 был экзоgenously экспрессируется совместно с PCEgag РНК плазмиды трансфекции для облегчения сборки RNP в растущих клетках. RNPs , содержащие белок оболочки MS2 с родственным MS2-меченой РНК PCEgag подвергали иммунопреципитации из клеточного экстракта и захватили на магнитных шариков (рис 2а). Для выборочного захвата компонентов RNP, присоединенные к PCE, иммобилизованного РНП инкубировали с олигонуклеотидом, комплементарным последовательностям дистальных к PCE, образуя гибрида РНК-ДНК, который является субстратом для активности РНКазы Н. Так как PCE позиционируется в 'терминале 5' 5'-нетранслируемой области, олигонуклеотид комплементарны последовательности РНК, смежных с ретровирусной сайта инициации трансляции (ГАГ старт-кодон). РНКазы H расщепления вблизи начала рвотным кодонов выпущен UTR комплекс 5 'от иммобилизованным RNP, который собирают в качестве элюента. После этого образец оценивали с помощью ОТ-ПЦР, чтобы подтвердить захват PCEgag и с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга, чтобы подтвердить captuповторно из белка оболочки мишени MS2. Валидация из PCE-ассоциированной РНК связывающего белка, DHX9 / РНК хеликаза А, затем выполняется.

Protocol

Буферные композиции Промывочный буфер: 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4 150 мМ NaCl 3 мМ MgCl2 С низким содержанием соли буфера: 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 10 мМ NaCl <…

Representative Results

Результаты предыдущих RIP определены ретровирусных кляп РНК и выбраны клеточные РНК , которые сопреципитат с DHX9 / РГА, в том числе ВИЧ-1, 6 Джунд 6 и Хур (Fritz и Борис-Лори, неопубликованный). Ретровирусный 5 'НТО было продемонстрировано, сопреципитата с DHX9 / RHA в я…

Discussion

Выделение RNP и стратегия идентификации родственным РНК, описанный здесь является выборочность средством изучения специфического взаимодействия РНК-белок и выявления кандидатов из белков совместно регулирующих конкретную RNP в клетках.

Преимущество использования олиг…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность поддержку НИЗ P50GM103297, P30CA100730 и Comprehensive Cancer P01CA16058.

Materials

Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D
Anti- FLAG antibody Sigma F3165
Anti- FLAG antibody Sigma F7425
Anti-RHA antibody Vaxron PA-001
TRizol LS reagent Life technology 10296-028
RNase H Ambion AM2292
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Isopropanol Fisher Scientific BP26184
RNaeasy clean-up column Qiagen 74204
Omniscript reverse transcriptase Qiagen 205113
RNase Out Invitrogen 10777-019
Protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Triton X-100 Sigma X100
NP-40 Sigma 98379
Glycerol Fisher Scientific 17904
Random hexamer primers Invitrogen N8080127
Oligo-dT primers Invitrogen AM5730G
PCR primers IDT Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage IDT Anti-sense primer for target RNA
Trypsin Gibco Life technology 25300-054
DMEM tissue culture medium Gibco Life technology 11965-092
Fetal bovine serum Gibco Life technology 10082-147
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Sodium chloride Fisher Scientific S642-212
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214
DTT Fisher Scientific R0862
Sucrose Fisher Scientific BP220-212
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 1620112
Magnetic stand 1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood For animal tissue culture
CO2 incubator For animal tissue culture
Protein gel apparatus Protein sample separation
Protein transfer apparatus Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%) Protein sample separation
Table top centrifuge Pellet down the sample
Table top rotator Mix the sample end to end
Vortex Mix the samples

References

  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

Play Video

Cite This Article
Singh, G., Fritz, S. M., Ranji, A., Singh, D., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution. J. Vis. Exp. (119), e54391, doi:10.3791/54391 (2017).

View Video