Summary

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

Published: January 16, 2017
doi:

Summary

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Abstract

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.

The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

Introduction

שלאחר תעתיק ביטוי גנים מוסדר בדיוק, החל שעתוק ה- DNA בגרעין. בשליטת RNA מחייב חלבונים (RBPs), biogenesis mRNA וחילוף החומרים להתרחש חלקיקים ribonucleoprotein מאוד דינמי (RNPs), אשר כלולות לנתק עם mRNA מבשר המצע במהלך ההתקדמות של RNA מטבוליזם 1-3. שינויים דינמיים רכיבי RNP להשפיע על הגורל שלאחר התעתיק של mRNA ולספק אבטחת איכות במהלך העיבוד של תמלילים עיקריים, הסחר ולוקליזציה הגרעין שלהם, פעילותם כתבניות mRNA לתרגום, ואת המחזור הסופי של mRNAs הבוגרת.

חלבונים רבים מיועדים RBPs מכוח תחומי חומצת אמינו המשומר שלהם, כוללים מוטיב הכרת רנ"א (RRM), תחום מחייב פעמים התקועות RNA (RBD), והוא משתרע של שאריות בסיסיות (למשל, ארגינין, ליזין, גליצין) 4. RBPs הם שגרתימבודד על ידי אסטרטגיות immunoprecipitation ו מוקרנים לזהות RNAs מאותו המקור שלהם. חלק RBPs שיתוף להסדיר-mRNAs מראש כי הם-קשורות מבחינה פונקציונלית, יועד regulons RNA 5-8. RBPs אלה, mRNAs מאותו המקור שלהם, ולפעמים RNA ללא קידוד, יוצרים RNPs קטליטי שמשתנה רכב; ייחודם נובע שילובים שונים של גורמים הקשורים, כמו גם לרצף הזמני, מיקום, ומשך האינטראקציות ביניהם 9.

Immunoprecipitation RNA (RIP) היא טכניקה רבת עוצמה כדי לבודד RNPs מתאי ולזהות תמלילי הקשורים באמצעות רצף ניתוח 10-13. מעבר מ מועמד הגנום כולו הקרנה אינה ריאלית באמצעות RIP בשילוב עם ניתוח microarray 14 או רצף תפוקה גבוהה (RNA-seq) 15. כמו כן, חלבונים-מזרז שיתוף יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה, אם הם נמצאים בשפע מספיק להפרדת הנוגדן מזרז-שיתוף 16,17. כאן, אנחנו כתובת המתודולוגיה לבידוד רכיבי RNP של רנ"א מאותו מקור ספציפי מתא אדם תרבותי, אם כי הגישה היא עָשׂוּי לְהִשׁתָנוֹת עבור lysates המסיס של תאי צמח, פטריות, וירוסים, חיידקים. ניתוחים Downstream של החומר כוללים זיהוי המועמד ואימות על ידי immunoblot, ספקטרומטריית מסה, assay האנזימטית ביוכימיים, RT-qPCR, microarray, ו RNA-seq, כפי שמסוכם איור 1.

בהתחשב התפקיד הבסיסי של RNPs בשליטת ביטוי גנים ברמה שלאחר התעתיק, שינויים בביטוי של RBPs רכיב או נגישותן מאותו מקור RNAs יכול להיות מזיק עבור התא ומזוהה עם כמה סוגים של הפרעות, כולל מחלות נוירולוגיות 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) הוא הכרחי עבור התרגום של mRNAs שנבחרו ממוצא הסלולר retroviral 6. RNAs מאותו מקור אלה להפגין אלמנטים ציס-מתנהג מבנית הקשורה בתוך שלהם5 'UTR, אשר יועד אלמנט השליטה שלאחר תעתיק (PCE) 19. RHA-PCE שפעילות מתבקשת על תרגום הכובע תלוי היעיל של רטרווירוסים רבים, כולל HIV-1, ושל גני רגולטוריים צמיחה, כוללים ג'ונד 6,20,21. קודד על ידי גן חיוני (dhx9), RHA חיוני התפשטות תא ומטה בתקנה שלה מבטל כדאיויות תא 22. הניתוח המולקולרי של RHA-PCE RNPs הוא צעד חיוני כדי להבין מדוע פעילות RHA-PCE יש צורך לשלוט התפשטות תאים.

האפיון המדויק של רכיבי RNP RHA-PCE על מצב יציב או על הפרעות פיסיולוגיות של התא דורש להעשרת סלקטיבית לכידתו של RNPs RHA-PCE בשפע מספיק לניתוח במורד זרם. הנה, retroviral PCEgag RNA תויגה עם 6 עותקים של אתר הקישור RNA ציס-מתנהג לחלבון מעיל MS2 (CP) בתוך מסגרת קריאה פתוחה. החלבון מעיל MS2 היה Exoהשיתוף הביע genously עם RNA PCEgag ידי transfection פלסמיד כדי להקל על הרכבת RNP בתאים גדלו. RNPs המכיל חלבון מעיל MS2 עם RNA PCEgag מאותו מקור MS2-tagged היו immunoprecipitated מהתמצית התא שנתפסו על חרוזים מגנטיים (איור 2 א). כדי סלקטיבי ללכוד את רכיבי RNP המאוגדים PCE, את משותקת RNP הודגר עם oligonucleotide משלים רצפי דיסטלי PCE, ויוצרים היברידי RNA-DNA כי הוא המצע לפעילות RNase H. מאז PCE ממוקמת ב 'מסוף של 5' 5 באזור הלא מתורגם, את oligonucleotide היה משלים רצפי הרנ"א סמוך לאתר תחילת התרגום retroviral (קודון ההתחלה איסור פרסום). RNase H מחשוף בסמוך לנקודת התחלת איסור פרסום קודון שוחרר במתחם UTR '5 מן RNP המשותקת, אשר נאספה כמו eluent. לאחר מכן, המדגם הוערך על ידי RT-PCR כדי לאשר את לכידתו של PCEgag ועל ידי PAGE ו immunoblot SDS כדי לאשר את captuמחדש של חלבון מעיל MS2 היעד. אימות של חלבון מחייב PCE הקשורים RNA, DHX9 / RNA helicase A, בוצע אז.

Protocol

קומפוזיציות הצפה לשטוף הצפה: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 150 מ"מ NaCl 3 מ"מ MgCl2 נמוך מלח הצפה: 20 mM Tris-HCl, 7.5 pH 10 מ"מ NaCl 3 מ"מ MgCl2…

Representative Results

תוצאות RIP לפני מזוהה RNAs איסור פרסום retroviral נבחרים RNAs הסלולר כי שיתוף המשקע עם DHX9 / RHA, כולל HIV-1 6, ג'ונד 6 וחור (פריץ ובוריס-לאוורי, לא פורסם). 5 retroviral 'UTR הודגמה לשתף המשקע עם DHX9 / RHA בגרעין לשתף לבודד בציטופלסמה על polyribosomes. זה מוגדר באופן ייחוד…

Discussion

בידוד RNP ואסטרטגית זיהוי RNA מאותו המקור המתואר כאן הוא אמצעי סלקטיבית של חוקרת אינטראקצית RNA חלבון ספציפית לגילוי חלבוני מועמד שיתוף ויסות RNP ספציפי בתאים.

היתרון של שימוש מכוון oligonucleotide מחשוף RNase H לבודד RNPs הוא היכולת ללכוד במיוחד …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים תמיכה בהכרת תודה על ידי NIH P50GM103297, P30CA100730 ומקיף סרטן P01CA16058.

Materials

Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein G Invitrogen 10004D
Anti- FLAG antibody Sigma F3165
Anti- FLAG antibody Sigma F7425
Anti-RHA antibody Vaxron PA-001
TRizol LS reagent Life technology 10296-028
RNase H Ambion AM2292
Chloroform Fisher Scientific BP1145-1
Isopropanol Fisher Scientific BP26184
RNaeasy clean-up column Qiagen 74204
Omniscript reverse transcriptase Qiagen 205113
RNase Out Invitrogen 10777-019
Protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Triton X-100 Sigma X100
NP-40 Sigma 98379
Glycerol Fisher Scientific 17904
Random hexamer primers Invitrogen N8080127
Oligo-dT primers Invitrogen AM5730G
PCR primers IDT Gene specific primers for  PCR amplification
Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage IDT Anti-sense primer for target RNA
Trypsin Gibco Life technology 25300-054
DMEM tissue culture medium Gibco Life technology 11965-092
Fetal bovine serum Gibco Life technology 10082-147
Tris base Fisher Scientific BP152-5
Sodium chloride Fisher Scientific S642-212
Magnesium chloride Fisher Scientific BP214
DTT Fisher Scientific R0862
Sucrose Fisher Scientific BP220-212
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 1620112
Magnetic stand 1.7 ml micro-centrifuge tube holding
Laminar hood For animal tissue culture
CO2 incubator For animal tissue culture
Protein gel apparatus Protein sample separation
Protein transfer apparatus Protein sample transfer
Ready to use protein gels (4-15%) Protein sample separation
Table top centrifuge Pellet down the sample
Table top rotator Mix the sample end to end
Vortex Mix the samples

References

  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

Play Video

Cite This Article
Singh, G., Fritz, S. M., Ranji, A., Singh, D., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution. J. Vis. Exp. (119), e54391, doi:10.3791/54391 (2017).

View Video