عزل مجمعات RNA والبروتينات وما شابه ذلك من الخلايا عن طريق شطف موجهة قليل النوكليوتيد-
Summary
This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5′ untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.
Abstract
Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5′ untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5′ terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.
Introduction
وينظم التعبير الجيني في مرحلة ما بعد النسخي على وجه التحديد، بدءا من النسخ الحمض النووي في النواة. التي يسيطر عليها الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية)، مرنا نشوء حيوي والتمثيل الغذائي تحدث في جزيئات بروتين نووي ريبوزي ديناميكية للغاية (RNPs)، التي الزميلة وفصل مع مرنا الركيزة السلائف خلال تطور من الحمض النووي الريبي الأيض 1-3. التغيرات الديناميكية في الأداء الملاحي المطلوب مكونات تؤثر على مصير ما بعد النسخي من مرنا وتوفير ضمان الجودة أثناء معالجة النصوص الأساسية، والاتجار النووي والترجمة، ونشاطهم كقوالب مرنا للترجمة، ودوران في نهاية المطاف من mRNAs ناضجة.
وتتم تسمية العديد من البروتينات كما الممارسات التجارية التقييدية بحكم مجالاتهم الأحماض الأمينية الحفظ، بما في ذلك فكرة الاعتراف RNA (RRM) والحمض النووي الريبي RNA المزدوج نطاق ملزم (RBD)، وتمتد من مخلفات الأساسية (على سبيل المثال، أرجينين، ليسين، والجلايسين) 4. الممارسات التجارية التقييدية بشكل روتينيعزل باستراتيجيات مناعي ويتم فحص لتحديد الرنا الخاصة وما شابه ذلك. بعض الممارسات التجارية التقييدية شارك في تنظيم مسبقا من mRNAs التي ترتبط وظيفيا، تسمى regulons RNA 5-8. هذه الممارسات التجارية التقييدية، من mRNAs المشابهة لها، وأحيانا غير الترميز الحمض النووي الريبي، تشكل RNPs الحفازة التي تختلف في تكوينها. طابعها الفريد ويرجع ذلك إلى مجموعات مختلفة من العوامل المرتبطة بها، وكذلك لالزمنية تسلسل، والموقع، ومدة تفاعلاتها 9.
RNA مناعي (رض) هي تقنية قوية لعزل RNPs من الخلايا والتعرف على النصوص المرتبطة باستخدام تحليل تسلسل 10-13. الانتقال من مرشح لالجينوم على نطاق الفحص ممكنا من خلال RIP جنبا إلى جنب مع تحليل ميكروأري 14 أو التسلسل الإنتاجية العالية (RNAseq) 15. وبالمثل، يمكن تحديد البروتينات عجل شارك الطيف الكتلي، وإذا كانت وفيرة بما فيه الكفاية وفصل من-عجل شارك الأجسام المضادة 16،17. هنا، نحن معالجة منهجية لعزل مكونات الأداء الملاحي المطلوب من الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك محدد من الخلايا البشرية المستزرعة، على الرغم من أن هذا النهج هو قابل للتغيير للست] القابلة للذوبان من خلايا النبات والفطريات والفيروسات والبكتيريا. وتشمل التحليلات التحويلية للمواد تحديد مرشح والتحقق من طخة مناعية، مطياف الكتلة، والكيمياء الحيوية فحص الأنزيمية، RT-QPCR، ميكروأري، وRNAseq، كما هي ملخصة في الشكل 1.
ونظرا للدور الأساسي للRNPs في السيطرة على التعبير الجيني في مرحلة ما بعد النسخي، وتعديلات في التعبير عن الممارسات التجارية التقييدية المكونة أو إتاحتها للالمشابهة الرنا يمكن أن يكون ضارا للخلية وترتبط مع عدة أنواع من الاضطرابات، بما في ذلك مرض عصبي 18. DHX9 / RNA هيليكاز ألف (رحه) ضروري لترجمة من mRNAs مختارة من أصول الخلوية وفيروسات 6. هذه الرنا وما شابه ذلك يحمل عناصر رابطة الدول المستقلة المفعول ذات الصلة هيكليا داخل بهم5 'UTR، التي اعتبرت بمثابة عنصر تحكم ما بعد النسخي (PCE) 19. النشاط رحه-PCE ضروري لكفاءة الترجمة التي تعتمد على الحد الأقصى من العديد من الفيروسات، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية-1، والجينات التنظيمية النمو، بما في ذلك جند 6،20،21. المشفرة بواسطة الجينات الأساسية (dhx9)، رحه أمر ضروري لتكاثر الخلايا والتنظيم وصولا ليقضي على بقاء الخلية 22. التحليل الجزيئي للرحه-PCE RNPs هو خطوة أساسية لفهم لماذا النشاط رحه-PCE ضروري للسيطرة على انتشار الخلايا.
توصيف دقيق لمكونات الأداء الملاحي المطلوب رحه-نفقات الاستهلاك الشخصي في حالة مستقرة أو عند اضطراب الفسيولوجية للخلية يتطلب تخصيب انتقائية والقبض على RNPs رحه-PCE في وفرة كافية لتحليل المصب. هنا، كانت المعلمة فيروسات PCEgag RNA مع 6 نسخ من الموقع RNA رابطة الدول المستقلة المفعول ملزم للبروتين معطف MS2 (CP) في إطار القراءة المفتوح. البروتين معطف MS2 كان إكسوgenously المشارك أعرب مع PCEgag الحمض النووي الريبي ترنسفكأيشن البلازميد لتسهيل تجميع الأداء الملاحي المطلوب في نمو الخلايا. تم immunoprecipitated RNPs التي تحتوي على البروتين معطف MS2 مع المعلمة MS2-وما شابه ذلك PCEgag الحمض النووي الريبي من استخراج الخلايا والقبض على حبات مغناطيسية (الشكل 2A). لالتقاط انتقائي مكونات الأداء الملاحي المطلوب منضمة إلى نفقات الاستهلاك الشخصي، والمحتضنة في الأداء الملاحي المطلوب ثبتوا مع قليل النوكليوتيد مكملة لتسلسل البعيدة لنفقات الاستهلاك الشخصي، وتشكيل الهجين RNA-DNA الذي هو الركيزة للنشاط ريبونوكلياز H. منذ يتم وضع نفقات الاستهلاك الشخصي في "محطة من 5 '5 المنطقة غير المترجمة، وكان قليل النوكليوتيد مكملة لتسلسل الحمض النووي الريبي المتاخمة للفيروسات الموقع ترجمة البدء (أسكت بداية كودون). ريبونوكلياز H انشقاق قرب بدء هفوة كودون صدر مجمع UTR 5 'من الأداء الملاحي المطلوب يجمد، والتي تم جمعها كما شاطف. بعد ذلك، تم تقييم العينة RT-PCR لتأكيد القبض على PCEgag وSDS PAGE وطخة مناعية لتأكيد captuإعادة البروتين معطف MS2 الهدف. والتحقق من الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين المرتبط نفقات الاستهلاك الشخصي، DHX9 / RNA هيليكاز A، ثم تم القيام بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
العزلة الأداء الملاحي المطلوب واستراتيجية تحديد الحمض النووي الريبي وما شابه ذلك وصفت هنا هي وسيلة انتقائية التحقيق في تفاعل معين RNA والبروتينات واكتشاف البروتينات مرشح شارك في تنظيم والأداء الملاحي المطلوب معين في الخلايا.
وم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
والكتاب الامتنان الدعم من قبل المعاهد الوطنية للصحة P50GM103297، P30CA100730 والشامل للسرطان P01CA16058.
Materials
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F3165 | |
| Anti- FLAG antibody | Sigma | F7425 | |
| Anti-RHA antibody | Vaxron | PA-001 | |
| TRizol LS reagent | Life technology | 10296-028 | |
| RNase H | Ambion | AM2292 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26184 | |
| RNaeasy clean-up column | Qiagen | 74204 | |
| Omniscript reverse transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 5056489001 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| NP-40 | Sigma | 98379 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 17904 | |
| Random hexamer primers | Invitrogen | N8080127 | |
| Oligo-dT primers | Invitrogen | AM5730G | |
| PCR primers | IDT | Gene specific primers for PCR amplification | |
| Oligonucleotide for RNase H mediated cleavage | IDT | Anti-sense primer for target RNA | |
| Trypsin | Gibco Life technology | 25300-054 | |
| DMEM tissue culture medium | Gibco Life technology | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technology | 10082-147 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S642-212 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214 | |
| DTT | Fisher Scientific | R0862 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Magnetic stand | 1.7 ml micro-centrifuge tube holding | ||
| Laminar hood | For animal tissue culture | ||
| CO2 incubator | For animal tissue culture | ||
| Protein gel apparatus | Protein sample separation | ||
| Protein transfer apparatus | Protein sample transfer | ||
| Ready to use protein gels (4-15%) | Protein sample separation | ||
| Table top centrifuge | Pellet down the sample | ||
| Table top rotator | Mix the sample end to end | ||
| Vortex | Mix the samples |
References
- Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255 (2008).
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
- Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18 (2006).
- Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
- Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
- Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
- Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
- Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
- Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
- Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5′ untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
- Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
- Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
- Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
- Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5′ RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
- Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
- Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
- Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
- Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
- Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).
