Transcriptionnelle Analyse par Naissant ARN FISH<em> In Vivo</em> Cellules Trophoblast géants ou<em> In vitro</em> Cultures à court terme de ectoplacentaire Cône explants

procédures d'animaux ont été effectuées en conformité avec la protection des animaux approuvé et utilisent comité des protocoles Institut Curie (ACEE-IC) (C 75-05-18). Le travail a également été menée sous l'approbation du ministère français de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche pour l'utilisation des organismes génétiquement modifiés (numéro de contrat 5549CA-I). 1. Préparation des Sections de cryostat Recueillir des embryons à partir d' ovuler naturellement F1 C57BL / 6 x DBA / 2J , comme décrit dans Shea et al., 12. Au jour 7 de la gestation (E7), sacrifier vieux 8-12 semaine souris par dislocation cervicale. Recueillir l'ensemble conceptus ie decidua 12. Isolât conceptus E7, comme décrit dans Shea et al., 12. Placez-les dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant du PBS. Congeler la souris conceptus E7 pour les sections de cryostat. Préparer adaptés puits en feuille d'aluminium 1cm de hauteur ( «fait maison» en utilisant un verre Pasteur pipet). Déposer une goutte de milieu de congélation de tissu sur le fond de ce petit récipient. Déposez le conceptus dans le bon sens (ie, pour les sections longitudinales du conceptus devrait maintenir son orientation horizontale). Remplir le puits contenant le conceptus avec le tissu du milieu de congélation. Suspendre l' aide de pinces à vapeur au- dessus du N2 liquide afin de lui permettre de se congeler lentement – puis immerger le bloc dans le N2 liquide pendant quelques secondes jusqu'à ce qu'il devienne blanc. Par la suite, transférer le bloc dans un flacon de congélation et conserver à -80 ° C (peut stocker pendant plusieurs mois). Avant cryo-découpe, placer le bloc congelé contenant le conceptus à -20 ° C dans le cryostat pendant 30 minutes. Effectuer cryosections d'une épaisseur de 8 pm. Dépôt 4 sections sur une lame pour permettre la fixation efficace. Sections de place assez près pour se glisser sous un 18 x 18 mm 2 lamelle. Vérifiez la qualité de lasections (intactes et sans rayures) et l'orientation de l'embryon (sections longitudinales) avec un stéréomicroscope et choisir les sections appropriées pour une analyse ultérieure. Aussi rapidement que possible les déposer dans un bocal de Coplin et effectuer ARN FISH (voir 3.3.2). 2. Préparation de VAM secondaire Isoler le Conceptus (voir 1.1 et 1.2). Disséquer le E7 ectoplacentaire Cone (EPC) Utilisez un stéréomicroscope et des boîtes de Petri contenant du PBS stérile. Disséquer le decidua avec une pince. Pierce l'échantillon et des pinces ouvertes à déchirer les deux côtés de la decidua à part. Shell sur l'embryon. Utilisez des conseils de pinces fines fermées (Dumont n ° 5) dans une action de ciseaux pour séparer l'EPC de l'embryon proprement dit. Utilisez un soin particulier pour obtenir un échantillon parfaitement propre, distincte de tissus maternels, ainsi que de chorion et le jaune sac. Laver explants EPC dans du PBS. Avec une petite cuillère, transférer EPC disséquée individu à un-wel 4l assiette contenant une lamelle stérile dans le milieu. Derive VAM de EPCs Cultures à court terme. Préparer des plaques 4 puits contenant des lamelles. 12 stériliser mm de diamètre autour de lamelles de verre par immersion dans de l'éthanol, suivie d'un séchage à la flamme. Ajouter 0,5 ml de milieu à chaque puits EPC (milieu EPC: RPMI 1640 supplémenté avec 15% de FCS, 0,1 mM de 2-mercaptoéthanol et des antibiotiques). unique de dépôt, disséqués-EPCs au centre de la lamelle dans le puits le long du milieu de culture. Utilisez une pince fine pour appliquer la CBE sur la lamelle de verre. Culturefor 3-5 jours à 37 ° C, 5% de CO 2. Explant individuelle forme une excroissance qui se propage comme une monocouche de VAM aplatie (figure 2A). 3. ARN FISH NOTE: Les protocoles sont basés sur ceux décrits pour les cellules souches embryonnaires (CSE) à Chaumeil et al, 8 et Pollex et Heard 13.. avancée Preparation de solutions mères Préparer un tampon d'acétate de sodium 3 M pH 5,2. Préparer un tampon d'hybridation 2x contenant 40% (p / v) sulfate de dextrane sodique, 20 x BSA, 400 mM ribonucléoside vanadyle complexe (VRC) en 4x solution saline de citrate de sodium (SSC). Préparer un milieu de montage contenant 90% (v / v) de glycerol, 0,1% (p / v) de p-phénylènediamine, pH 9 dans du PBS. Des solutions fraîchement préparées Préparer la solution fixateur composé de 3% de paraformaldehyde fraîchement préparé (PFA) dans du PBS. Préparer une solution de perméabilisation contenant 0,5% de Triton-X-100 dans du PBS supplémenté avec 2 mM de VRC. Préparer le tampon de lavage en mélangeant 50% de formamide (FA) et 2x SSC et ajuster le pH à 7,2-7,4. Préparer une solution de contre-coloration à l'ADN consistant en 1 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) dans 2 x SSC. Fixation et perméabilisation dans la préparation de FISH Pour les cellules sur des lamelles, laver les cellules dans 1x PBS pendant 5 mdans. Fixer les cellules sur des lamelles couvre-embryonnaires ou des sections sur des lames pendant 10 minutes dans un fixateur (PFA 3%), la solution à la température ambiante. Rincer les cellules trois fois avec PBS 1x. Perméabiliser les cellules pendant 5 min dans une solution de perméabilisation glacée sur la glace. Laver les cellules trois fois avec 70% d'éthanol. lamelles de magasins dans les plaques 4 puits et diapositives dans la boîte de transport 4-diapositive dans 70% d'éthanol à -20 ° C. NOTE: Lamelles et diapositives peuvent être stockés pendant plusieurs mois à -20 ° C. Les plaques et les boîtes qui les contiennent doivent être scellés avec du parafilm pour éviter l'éthanol évaporation. Étiquetage DNA Probe Etiqueter sondes ADN par translation de coupure en utilisant des nucléotides fluorescents. Suivez les instructions du fabricant (voir le tableau 1) 8. Pour un mélange de réaction de 50 ul, ajouter 1-2 ug du plasmide, les chromosomes bactériens artificiels (BAC) ou le déplacement multiple amplification (MDA) (pour l'amplification d'ADN; voir 3.4.4) l'ADN à 17,5 ul d'eau, 2,5 ul de 0,2 mMSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 pi 10 mM de chaque mélange de dNTP (dGTP, dATP, dCTP), mM dTTP 5 pi 10, 5 ul 10x tampon de traduction nick et 8 pl nick traduction enzyme. Incuber pendant 16 heures à 15 ° C dans l'obscurité. Inactiver la réaction par congélation à -20 ° C. sondes de magasins pour mois à -20 ° C. MDA NOTE: Pour l'ADN de BAC, quantité d'ADN obtenue après préparation classique est faible, donc on peut utiliser une étape d'amplification de l'ADN avant le marquage en utilisant MDA. Utilisez un kit commercial et suivez les instructions du fabricant (voir le tableau 1). Mélanger l'ADN de BAC 0,5 pi avec 9,5 ul de tampon d'échantillon. Chauffer 3 min à 95 ° C. étancher immédiatement sur la glace; laisser sur la glace 10 min. Préparer un tampon de réaction / mélange enzymatique: (9,5 pi + 0,5 mélange d'enzymes pi) et garder sur la glace. Mélanger 10 ul de mélange d'ADN + 10 ul de tampon de réaction / mélange d'enzymes. Incuber à 30 ° C d'au moins 20 heures. Inactiver enzyme par exemple de chauffage 10 min à 65 & #176; C. échantillon Refroidir à 4 ° C avant de les stocker à -20 ° C. Vérifiez MDA par digestion. Ajouter 1 ul MDA, 2 ul 10x tampon, 2 ul Hind III et 15 pi de H 2 O. Incuber à 37 ° C pendant une nuit. Exécuter lentement sur un gel d'agarose à 0,8 à 1% pour confirmer l'amplification d'ADN exacte. Des fragments d'ADN clairs de masse moléculaire élevée doivent être observées sur le gel. Préparation de la sonde Utilisez 0,1 ou 1 pg sonde par lamelle ou glisser. NOTE: Ajouter 2-5 pg de Cot-1 DNA si la concurrence est nécessaire , par exemple, la plupart des sondes car ils peuvent contenir des séquences répétées qui d'hybrider autrement croix et augmenter fond. Pour la précipitation, ajouter 5 ug d'ADN de sperme de saumon, 1/10 de volume de 3 M d'acétate de sodium pH 5,2 et 3 volumes d'éthanol. Centrifuger à 16 000 x g et 4 ° C pendant 25 min. Laver granulés avec 70% d'éthanol et centrifuger à nouveau pendant 5 min. culot sec pendant 2 min dans un vac concentrateur / vitesse. Resuspendre sous forme de 100%amide dans la moitié du volume requis pour l' hybridation (par exemple, 2,5 pi pour lamelle ou 7 pi pour les sections embryonnaires sur la diapositive). Placer 30 min à 37 ° C sous agitation dans un ThermoMixer. Dénaturer pendant 7 minutes à 75 ° C. Quench sur la glace, ou si la concurrence est requise mis directement à 37 ° C pendant 30-60 min. Mélanger la solution de la sonde avec un volume égal de solution d'hybridation 2x. Hybridation et Washes Déshydrater; des lamelles dans les puits et les lames dans une jarre de Coplin, par lavage séquentiel dans 1x 80%, 1x 95% et 2x éthanol à 100% pendant 5 minutes chacun. lamelles et diapositives sécher complètement. Pour l'hybridation, appliquer la sonde mélange d'hybridation de 5 pi (voir 3.5) sur une lame et abaisser la lamelle, avec des cellules face dans le mélange d'hybridation. Pour les sections sur diapositive, appliquer 14 pi sonde mélange d' hybridation (voir 3.5) et couvrir avec un 18 x 18 mm 2 lamelle. Placer les lames dans une chambre humide (papier tissu trempé dans50% FA / 2x SSC) et incuber à 37 ° C pendant la nuit, dans l'obscurité. Washes Post-hybridation: Ajouter 1 ml de 50% FA / SSC 2x sur la lamelle sur la lame pour le desserrer; retirer la lamelle soigneusement de la diapositive (en prenant soin de ne pas gratter les cellules) et placez-cellule vers le haut dans une plaque 4 puits contenant 50% FA / 2x SSC. Pour les sections sur diapositive, retirer la lamelle d'une manière similaire et placer la lame dans une jarre de Coplin contenant 50% FA / 2x SSC. Effectuer 3 lavages, chacun pour 7 min avec préchauffée 50% FA / 2x SSC à 42 ° C ou 44 ° C pour lamelle ou glisser, respectivement. Effectuer 3 lavages avec préchauffée 2x SSC pendant 5 minutes chacun à 42 ° C ou 44 ° C pour lamelle ou glisser, respectivement. les noyaux par lavage à contre-colorant dans 2 x SSC avec 1 pg / ml de DAPI pendant 3 min à température ambiante. Rincer deux fois avec 2x SSC. Montage de Lamelles et Diapositives Pour les petites lamelle de culture VAM, appliquer 5 & #181; l milieu de montage sur une lame. Placez la cellule côté de la lamelle sur le dessus de la goutte. Pour diapositive avec sections, appliquer 15 pi de milieu sur la glissière de montage. Placer un mm 2 lamelle 22 x 22 sur le dessus de la goutte. Éviter les bulles. Essuyez solution de montage en excès hors tension. Sceller la lamelle avec une petite quantité de vernis à ongles. Si possible, l'image glisse immédiatement ou conserver pendant plusieurs mois à -20 ° C. 4. Microscopie et analyse Acquérir séquentielles images 3D axe z à 0,3 um en utilisant un microscope à fluorescence (objectif 63X) et effectuer l'analyse de 3D ​​piles d' images en utilisant le logiciel ImageJ 14.