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Immunology and Infection

La determinación de supresión del sistema inmunológico frente a la protección del SNC para Intervenciones farmacológicas en la desmielinización autoinmune

Published: September 12, 2016
doi:
10.3791/54348
, , , ,
1Physical Medicine and Rehabilitation,University of Alabama at Birmingham, 2Department of Pathology,University of Alabama at Birmingham, 3Department of Neurobiology,University of Alabama at Birmingham, 4Center for Glial Biology and Medicine,University of Alabama at Birmingham

Summary

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

Abstract

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

Introduction

La esclerosis múltiple (MS) se caracteriza por lesiones inflamatorias predominantemente en las regiones de la materia blanca del cerebro en la enfermedad temprana. Después de progresión a largo plazo, gris atrofia de la materia se detecta mediante imágenes de resonancia magnética y marca la fase neurodegenerativa de la enfermedad. gliosis reactiva, desmielinización y daño axonal en la sustancia blanca se atribuyen a las células inmunes que infiltran el SNC. Ninguno de los tratamientos utilizados actualmente en MS revertir o prevenir la neurodegeneración directamente en el SNC – en cambio, reducir la inflamación mediante la atenuación de la activación de células T y / o la infiltración en el sistema nervioso central. Debido a que no existe una cura para la EM y los pacientes que usan tratamientos actuales continúan experimentando progresión de la enfermedad, los descubrimientos de fármacos que impiden la desmielinización y la pérdida neuronal son de importancia crítica. Sin embargo, diferenciar entre los efectos sobre las células inmunes y los de la CNS puede ser difícil experimentalmente, como el resultado – es decir, la reducción de daños en el SNC – ve los sAME independientemente de los mecanismos mediante los cuales se produce. Por lo tanto, la evaluación de la protección CNS debe asoció con evaluaciones de CNS-infiltración de células y la proliferación de las células inmunes inmunes en la periferia para determinar cómo afecta a los agentes farmacológicos mecanismos de la enfermedad.

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal bien establecido de trastornos inflamatorios autoinmunes que era directamente responsable del descubrimiento de fármacos utilizados actualmente para tratar la EM 1-4. Los ratones a menudo se utilizan para EAE, con ratones C57BL / 6 de ser una cepa popular basada en la disponibilidad de variantes genéticas. C57BL / 6 ratones inducidos con EAE exhiben progresión de la enfermedad crónica con inicio alrededor de 10 días después de la inducción. La infiltración del parénquima de la médula espinal y cerebelo son características de la histopatología de estos animales, con ausencia de infiltración en el parénquima cortical 5. lesiones Además, corticales y desmielinización en el blluvia son características de la enfermedad 6-9, que son relativamente ausente en ratones C57BL / 6. Por lo tanto, puede ser preferible cuando es posible utilizar ratones SJL, que tienen la enfermedad de recaída-remisión y lesiones encontradas en el cerebro y la médula espinal que parecen similares a los de MS 10.

El tratamiento no puede ser clasificado como neuroprotector si las células inmunes nunca llegan al SNC. Por lo tanto, este protocolo hace uso de análisis de citometría de flujo de cerebro, médula espinal, y los bazos de ratones EAE para determinar los efectos del tratamiento sobre la infiltración de células inmunes en el SNC y la proliferación de células inmunes en la periferia, como se ha demostrado previamente 11. También se describen los análisis inmunohistoquímicos de tejido del SNC para determinar la extensión y naturaleza de la neuroprotección. La combinación de estos métodos permite la determinación de si las células inmunes se activan y proliferan en la periferia, si las células inmunes entraron en el CNS, y si el CNS era protected de la inflamación o daño. Si se sospecha de efectos neuroprotectores pesar de los efectos sobre el sistema inmune, los experimentadores pueden alterar el tratamiento se inicia veces después de la infiltración de células inmunes en ha producido el CNS.

A continuación, presentamos un protocolo utilizando dos modelos diferentes de la EAE activo, un modelo animal mediada por células T de la EM, y citometría de flujo análisis combinado con técnicas de inmunohistoquímica en varios puntos de tiempo durante la enfermedad para determinar la eficacia de las terapias experimentales en diferentes aspectos de patogénesis de MS. Este método ayudará a los investigadores en la diferenciación entre los efectos sobre la proliferación de células inmunes y la infiltración frente a protección de CNS, por lo que es más fácil a reducir cómo fármacos actúan sobre la patogénesis de enfermedades.

Protocol

procedimientos experimentales con ratones deben cumplir con las normas institucionales y gubernamentales pertinentes. Para el presente estudio, los ratones fueron alojados y tratados de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud y la Universidad de Alabama en Birmingham directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo. 1. Inducción y puntuación de EAE Induce EAE en ratones C57BL / 6 11-13 o ratones SJL 10,11 como se describió anteriormente 13. NOTA: El experimentador debe elegir un modelo ideal para su pregunta de investigación (véase la discusión para más detalles). Puntuaciones de registro diario describen como anteriormente 11 para cada ratón comenzando el día 7 después de la inducción. Comparar las puntuaciones medias diarias en el tiempo entre los grupos de tratamiento. 2. Tratamiento El tratamiento de los ratones con EAE antes de la aparición de la enfermedad para determinar si el tratamiento afecta a la infiltración de células inmunes o proliferación. Elegir un tratamiento, meDTO de la entrega, y la frecuencia de tratamiento, mientras que teniendo en cuenta la barrera hematoencefálica permeabilidad, la vida media, y la dosis de la droga. NOTA: EAE aumenta la barrera hematoencefálica permeabilidad y puede permitir que los medicamentos lleguen al SNC que de otro modo no podrá en animales sanos. La realización de experimentos para las curvas de dosis-respuesta que buscan en las puntuaciones clínicas de EAE puede ayudar en la elección de una dosis apropiada de drogas. los controles del vehículo deben llevarse a cabo de forma paralela al tratamiento farmacológico. Alternativamente, los ratones knockout condicional se pueden utilizar con los compañeros de camada como controles. Utilice SJL o ratones C57BL / 6 para este experimento. El tratamiento de los ratones poco después de la inducción de EAE (día 7), antes del inicio de los síntomas utilizando el método de entrega elegido. Sacrificio y disección de los ratones en el pico de la enfermedad (aproximadamente el día 15), como en el paso 3.1 y sus sub-etapas, a partir de la media más alta puntuación clínica con el tiempo. Conducta citometría de flujo en la médula espinal de ratón (como en el paso 3.2) para determinar infiltrati de células inmunesen el SNC, y en el bazo (como en el paso 3.3) para determinar la proliferación de células inmunes en la periferia. En los ratones separados, conducta inmunohistoquímica (como en el paso 4) para cuantificar los astrocitos y microglia, y la preservación de la mielina. El tratamiento de los ratones con EAE después de la aparición de la enfermedad para determinar si el tratamiento protege el sistema nervioso central después de producirse la infiltración de células inmunes. Repita el paso 2.1.1. Utilice ratones SJL para este experimento, ya que estos ratones tienen remisiones enfermedad medible. El tratamiento de los ratones durante el primer pico de la enfermedad (o, si se desea, en la cima de una recaída después), medida por las puntuaciones clínicas promedio. Sacrificar los ratones en una inducción de tiempo posterior a la EAE deseada. Debido a la infiltración ya se ha producido, puede no ser útil para medir la infiltración por análisis FACS. Sin embargo, tomar las médulas espinales de cuantificar gliosis reactiva y la mielina para determinar si existe una protección CNS pesar de infiltración de células inmunes. 3. Análisis de citometría de flujo Disección Etiqueta de tres tubos de 15 ml cónicos (uno para el cerebro, una para la médula espinal, y una para el bazo) por animal con el ID del animal y el tipo de tejido contenidas. Mantenga todos los tejidos en tubos separados durante todo el procedimiento en el hielo. Para el análisis FACS de los bazos, sacrificar los ratones en el pico de la enfermedad (~ días de inducción 15 post-EAE) usando dióxido de carbono con una velocidad de flujo de aproximadamente 15% del volumen del envase por minuto durante 2 – 3 min. Confirmar la eutanasia por la falta de respiración. Tras el sacrificio de cada ratón, extirpar el bazo y el lugar 14 en un individuo, con la etiqueta 15 ml tubo cónico (de la etapa 3.1.1) que contiene hielo frío RPMI suplementado con 2% de FCS, 100 UI de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina ( a que se refiere como "medios" a través del protocolo). Para el análisis FACS de cerebro y la médula espinal, realice la perfusión cardiaca mediante la reducción de la aurícula derecha del ratón con tijeras quirúrgicas para liberar circulating sangre y la perforación del ventrículo izquierdo con una aguja conectada a una jeringa llena con 10 ml de PBS enfriado en hielo. inyectar lentamente los 10 ml de PBS. Cortar la cabeza de ratón y haga un corte a la línea media del cuero cabelludo con tijeras quirúrgicas. Pelar la piel de la espalda con la mano o con unas pinzas y haga un corte a la línea media del cráneo con tijeras quirúrgicas, utilizando el punto de entrada de la médula espinal como un punto de partida. Despegar el cráneo con micro fórceps y usar una cuchara para liberar el cerebro. Coloque los cerebros en la etiqueta 15 ml tubos cónicos (de la etapa 3.1.1) que contienen los medios de comunicación. Retire la piel del ratón con pinzas y tijeras quirúrgicas, y eviscerar el ratón utilizando tijeras quirúrgicas. Cortar las extremidades, cola, costillas, y cualquier músculo que rodea con unas tijeras quirúrgicas para liberar la columna vertebral. Cortar la columna vertebral, en unos 5 piezas aproximadamente iguales con tijeras quirúrgicas y apretar un extremo de una pieza con una pinza hemostática, y luego usar otra pinza hemostática to seguir apretando, moviéndose a lo largo de la pieza hasta la médula espinal exprime de la parte superior. Repita este procedimiento para cada pieza de la columna vertebral y colocar las cuerdas en el individuo, la etiqueta 15 ml tubos cónicos (de la etapa 3.1.1) que contienen los medios de comunicación. Evaluación de la infiltración de células inmunes en el cerebro y la médula espinal Cortar cerebro y médula espinal en trozos pequeños con unas tijeras estériles. Triturar con el émbolo de una jeringa de 3 ml más de un filtro de células de 70 m en un nuevo tubo de 50 ml mientras se lava el filtro con medios de comunicación. Llevar a cada tubo a un volumen de 50 ml con medios de comunicación. Centrifugar a 453 xg durante 5 min a las células de pellets. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 4 ml de medios de gradiente de densidad de 40%. superponer cuidadosamente el gradiente de densidad de 40% que contenía las células en la parte superior de 2 ml de gradiente de densidad de 70% en un nuevo 15 ml cónica tubo de pipeta muy lentamente sobre la pared del tubo cónico para asegurar estratificación adecuado del gradiente. Girar a 796 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente conun freno. Retirar con cuidado la capa de mielina superior del gradiente con una pipeta de transferencia de 1 ml, a continuación, eliminar las células viables en la interfase con una pipeta y la transferencia de 1 ml de la transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Llevar el tubo de 15 ml con medio y se centrifuga a 448 xg durante 10 min. sedimento se vuelve a suspender en 200 l de medios y colocar en un pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo (cada muestra de cada animal voy a entrar en su propio pozo). Centrifugar la placa a 410 xg durante 5 min. Flick fuera del pellet sobrenadante y resuspender en 200 l de los medios de comunicación reestimulación (RPMI suplementado con 10% FCS, 100 UI / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales 1x, piruvato sódico 1 mM y 55 mM β-mercaptoetanol, además de 50 ng / ml de forbol miristato acetato (PMA), 750 ng / ml de ionomicina, y el inhibidor de transporte de proteínas Brefeldina A). Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 4 horas. NOTA: PMA y ionomresultados de reestimulación ycin en la activación de todos los linfocitos-independientemente de su especificidad de antígeno T a fin de evaluar el número total de cada subconjunto de células T en el tejido dado. Sin embargo, las respuestas de células T efectoras específicas de antígeno se pueden evaluar de varias maneras, incluyendo volviendo a estimular las células con péptido MOG en presencia de Brefeldina A 15,16. Evaluación de fenotipos de células T CD4 + CNS Después de la incubación, se centrifuga la placa de fondo redondo de 96 pocillos (de la etapa 3.2.5), a 410 xg durante 5 min y con un tirón el sobrenadante. Todas las siguientes etapas de tinción se llevan a cabo en esta placa. Lavar las células en 200 l de PBS con 2% de FCS y se centrifuga a 410 xg durante 5 min. Flick el sobrenadante y se incuban las células con 200 l de PBS que contiene 2% de FCS con Fc Block (clon 2.4G2) durante 10 – 15 min en hielo. Para comenzar la mancha extracelular, las células de centrifugación a 410 xg durante 5 min, el sobrenadante película, y sedimento se vuelve a suspender en 50 y# 956; l de cóctel de mancha superficie que contiene anticuerpos fluoróforo marcado contra CD4 (1: 200, 1 mg / ml), TCR (1: 200, 1 mg / ml), y el tinte de viabilidad (1: 500) diluido en PBS durante 15 min en hielo. centrifugar las células a 410 xg durante 5 min y el sobrenadante película. Lavar las células 2x en 200 l de PBS y centrifugar a 410 g durante 5 min. Después de quitar la mancha extracelular, iniciar el procedimiento de tinción intracelular por fijación / permeabilización seguido por tinción intracelular. Para empezar, toca ligeramente el sobrenadante y fijar / permeabilizar las células con el factor de transcripción Foxp3 reactivos de tinción 17 (de acuerdo con las instrucciones del fabricante; véase Materiales Lista) durante 30 minutos a la noche a 4 ° C Lavar las células en tampón de permeabilización de 150 l de la placa de kit y se centrifuga a 410 xg durante 5 min. Flick off células sobrenadante y las manchas en el tampón de permeabilización de 50 l con fluoróforo marcado con anticuerpos contra la IL-17A (1: 200, 1 mg / ml), IFN-γ (1: 200, 1 mg / ml), y Foxp3 (1: 200, 2,5 g / ml) diluido en PBS durante 30 min en hielo. centrifugar las células a 410 xg durante 5 min y el sobrenadante película. Para eliminar el exceso de anticuerpos se lavan 3x en tampón de permeabilización de 200 l y centrifugar a 410 xg durante 5 min. Flick el sobrenadante y resuspender en 200 l de PBS. Analizar las células por citometría de flujo, gating en CD4 vivo + TCR + células como se describió anteriormente 11 para evaluar el porcentaje de células que expresan cada molécula. Contar las células usando un hemocitómetro 18 u otro método validado para determinar el número de células por ratón con cada uno de los fenotipos de células T CD4 +. Utilizando los datos obtenidos, calcular el porcentaje y el número de células T CD4 + infiltrarse en el cerebro y la médula espinal de cada ratón, con un enfoque particular en estas poblaciones, que desempeñan un papel crítico en la patogénesis de EAE y protección19: IL-17A + IFN-γ -, IL-17A + IFN-γ +, la IL-17A – IFN-γ +, + Foxp3. Evaluación de la proliferación de las células T periféricas y la activación Aplastar el bazo con portaobjetos de vidrio esmerilado en una placa de cultivo de 60 x 15 mm. Coloque suspensión de células en un tubo cónico de 15 ml usando medios de comunicación para suspender las células. Llenar el tubo de 15 ml con células de los medios de comunicación y centrifugar a 448 xg durante 5 min. Aspirar los medios de comunicación y resuspender sedimento en 2 ml de lisado ACK tampón a RT para lisar las células rojas de la sangre durante aproximadamente 3 min. Llevar tubo a volumen de 15 ml con medios de comunicación y la tensión sobre un filtro de células de 70 m en un nuevo tubo. Centrifugar las células a 448 xg durante 5 min, aspirar el sobrenadante, y resuspender en 2 ml de medio. Evaluación de la proliferación de células T periféricas de CD4 + por tinción con Ki-67 Coloque una pequeña alícuota (típicamente 200 l) de la ecuaciónuivalent número de esplenocitos de 3.3.3 en pocillos individuales (una por muestra) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Centrifugar a 410 xg durante 5 min y el sobrenadante flick. Resuspender en 200 l de PBS que contiene 2% de FCS y repetir la centrifugación. Flick off células sobrenadante y resuspender con PBS que contenía 2% FCS con Fc Block (clon 2.4G2) y se incuba durante 10 – 15 min en hielo. Para tinción extracelular repita el paso 3.2.6.3. Después de quitar la mancha extracelular, iniciar el procedimiento de tinción intracelular por fijación / permeabilización seguido por tinción intracelular. Repita el paso 3.2.6.4.1. centrifugar las células a 410 xg durante 5 min y el sobrenadante película. células de lavado 1X en 200 l de tampón de permeabilización del kit y se centrifuga a 410 xg durante 5 min. Flick off células sobrenadante y las manchas en el tampón de permeabilización de 50 l con anti-Ki-67 anticuerpo (1: 200, 1 mg / ml) durante 30 min. centrifugar las células a 410 xg for 5 min y el sobrenadante película. Lavar las células 2x en 200 l de tampón de permeabilización del kit y se centrifuga a 410 xg durante 5 min. Flick el sobrenadante y lavar las células 1x en 200 l de PBS y se centrifuga a 410 g durante 5 min. Analizar las células por citometría de flujo, gating en CD4 vivo + TCR + células como se describió anteriormente 11, luego evaluar porcentaje de células Ki-67 +. Evaluación de fenotipos periféricos de células T CD4 + Coloque 200 l de células (de la etapa 3.3.3) en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (un pocillo por muestra) y se centrifuga a 410 xg durante 5 min y re-estimular como en 3.2.5. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C durante 4 horas. Realice el mismo procedimiento de tinción que en el paso 3.2.6 y sus sub-pasos. Analizar las células por citometría de flujo como en 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5. 4. Inmunohistoquímica unad Cuantificación preparación de tejidos Sacrificar los ratones con EAE en un experimento separado de los utilizados en el paso 3 y sus sub-etapas en cualquier momento después de la inducción de EAE (a menudo ~ día 30, durante la fase crónica de la enfermedad de ratones C57BL / 6 o durante un máximo en promedio de las puntuaciones clínicas para los ratones SJL) siguiendo los pasos siguientes para determinar el alcance de la gliosis reactiva y la desmielinización. Anestesiar a los ratones con isoflurano al 2,5% y el 97,5% de oxígeno y confirmar la profundidad apropiada de la anestesia con una punta suave pellizcar el uso de fórceps, en busca de una falta de respuesta. Realizar la perfusión transcardiaca como se describe en el paso 3.1.3. Después de la inyección de PBS en el ventrículo izquierdo, utilice una nueva jeringa para inyectar 10 ml de paraformaldehído al 4% en PBS PRECAUCIÓN:. Paraformaldehído es un irritante de la piel y los pulmones, puede causar graves daños a los ojos, y se sospecha que provoca cáncer. Evitar la inhalación, ingestión y en contacto con la piel y los ojos. La perfusión se debe realizar en una campana de humos. </li> Retire cerebros y columnas vertebrales como se describe en los pasos 3.1.4 – 3.1.6. Ate columnas vertebrales de palos con la cadena para asegurar una alineación recta de la médula espinal. Ponga cerebros en viales de centelleo con la etiqueta de identificación del animal con unos 20 ml de paraformaldehído al 4% en PBS, y las médulas espinales en 50 ml tubos cónicos con la etiqueta de identificación del animal con aproximadamente 50 ml de paraformaldehído al 4% en PBS hasta después de la solución durante la noche. Para cryoprotect cerebros, enjuagar 3 veces en PBS 1x y se almacena a 4 ° C en 30% de sacarosa en PBS 1x. Permitir que los cerebros para caer al fondo de sus receptáculos (cerca de 3 días). Eliminar el calcio de la columna vertebral de un enjuague 3 veces en 1 x PBS y colocándolo en un gran volumen (aproximadamente 50 ml para un ratón de la médula espinal) de 0,5 M EDTA en 1x PBS (empezando pH será ~ 10; pH a ~ 7,8 con 6 N de HCl) durante 2 – 3 semanas hasta que el hueso ya no es rígido. Cryoprotect la columna vertebral, siguiendo el paso 4.1.5. cerebros y incrustarcolumnas vertebrales en OCT siguientes sub-pasos tan pronto a medida que caen a la parte inferior de sus contenedores. Hacer una mezcla de 1 parte 30% de sacarosa en PBS 1x y 2 partes OCT (por ejemplo, añadir 15 ml 30% de sacarosa en PBS 1x a 30 ml OCT). Agregar la mezcla de OCT / sacarosa al molde de inclusión (22 x 22 x 20 mm para los cerebros y 22 x 30 x 20 mm para la médula espinal) hasta que es alrededor de ½ completa. Cortar las columnas vertebrales en 6 piezas de igual tamaño utilizando una hoja de afeitar y colocar en un molde de 22 mm de incrustación x 30 x 20 mirando hacia adelante para las secciones coronales de la médula espinal. Coloque todo el cerebro en 22 moldes x 22 x 20 mm hacia delante. Añadir octubre mezcla / sacarosa para cubrir el tejido y dejar reposar durante 1 hora. lo que las burbujas pueden escapar. Durante esta hora, añadir 2-metilbutano a un plato que puede contener moldes de inclusión para el flash-congelación. Coloque el plato en hielo seco y cubrir para pre-enfriar. Flash-congelar el molde en 2-metilbutano en hielo seco y almacenar a -80 ° C en el interior de acontainer para prevenir la deshidratación. Cuando esté listo, la sección de tejido en 16 m con un criostato y montar en portaobjetos con carga electrostática. Poner cada sección de 10º sobre un portaobjetos de cada uno para el cerebro y la médula espinal (por ejemplo, deslizar 1 tendrá las secciones 1, 11 y 21, y deslice 2 tendrá las secciones 2, 12 y 22, y así sucesivamente). Tienda desliza a -80 ° C o utilizar de inmediato para la tinción. La tinción de gliosis reactiva y la mielina Cuando esté listo para la tinción, elegir una diapositiva cada para el cerebro y la médula espinal por mancha para cada animal en el mismo (o lo más similar posible) región. Para el cerebro, elija diapositivas que muestran el cuerpo calloso y el haz del cíngulo. Colocar los portaobjetos con el tejido en un bloque de calor a 70 ° C durante 7 minutos. Después de 7 minutos apagar el bloque de calor y dejar que se enfríen las diapositivas en el bloque de calor durante otros 10 – 15 min. Esto evitará que las secciones de tejido de la caída de los portaobjetos durante el procedimiento de tinción. Lavar los portaobjetos 3 veces en 1 x PBS con 0,1% de detergente no iónico (por antígenos intracelulares) o 1x PBS (por anticuerpos dirigidos a los antígenos de superficie) durante 5 min. NOTA: Debido a que los anticuerpos utilizados en este protocolo son intracelulares, detergentes no iónicos se pueden utilizar en las etapas subsiguientes. Nunca permita que se sequen por completo después de este paso. Colocar los portaobjetos en un recipiente y cubrir con tampón citrato pH 3,0. Para hacer tampón de citrato, añadir 0,192 g de ácido cítrico anhidro a un volumen final de 100 ml en agua. Ajustar el pH con ácido acético si por encima de pH 3,0 o NaOH si a continuación. Incubar los portaobjetos a 37 ° C durante 30 min y se lava 3 veces en 1 x PBS con detergente no iónico 0,1% durante 5 min. Circle un área alrededor del tejido con un bolígrafo barrera hidrófoba y colocar los portaobjetos en una cámara humidificada (por ejemplo, una caja de portaobjetos que contiene toallas de papel húmedo). Añadir tampón de bloqueo al tejido. Incubar durante 30 min a TA. NOTA: tampón de bloqueo consiste en 1x PBSmás 0,3% de detergente no iónico y el suero apropiado (5%) en base a la cantidad de anticuerpo secundario, es decir, la proteína de suero de caballo para básica de la mielina (MBP) y la proteína ácida glial fibrilar (GFAP), y suero de cabra para Iba1. tampón de bloqueo fuera de las diapositivas y añadir anticuerpo primario Flick (1: 1000 o la proteína básica de 0,2 g / ml de cabra anti-mielina de los oligodendrocitos, 1: 1.000 o 1 mg / ml a 3 mg / ml de ratón anti-GFAP para astrocitos, o 1 : 750 o 0,67 g de conejo / ml anti-Iba1 para microglia) diluida en el tampón de bloqueo apropiado (véase el paso 4.2.6) a la zona de círculo. Deja a 4 ° C durante la noche en la cámara húmeda. anticuerpo Flick en tampón de bloqueo fuera de las diapositivas y lavar los portaobjetos 3 veces en 1 x PBS con detergente no iónico 0,1% durante 5 min. Añadir anticuerpo secundario (1: 200 o 7,5 mg / ml de caballo biotinilado anti-ratón para MBP y GFAP, o biotina de cabra anti-conejo para Iba1) diluida en el tampón de bloqueo adecuado (vea step 4.2.6) a la zona de círculo y dejar incubar diapositivas en la cámara humidificada durante 1 hora a RT. anticuerpo Flick en tampón de bloqueo fuera de las diapositivas y lavar los portaobjetos 3 veces en 1 x PBS con detergente no iónico 0,1% durante 5 min. Preparar complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC) en la inmunoperoxidasa (véase la lista de materiales) 30 minutos antes de su uso y agitar en un agitador hasta que se necesite en 4.2.12. Añadir 0,3% de H 2 O 2 en metanol a la zona de círculo durante 10 min para inactivar la actividad de peroxidasa endógena. solución Flick de las diapositivas y lavar en 2 veces en 1X PBS o PBS 1x con detergente no iónico 0,1% durante 5 min, a continuación, 1 vez en 1 x PBS. Añadir reactivo ABC a la zona de un círculo de 30 min. solución Flick de las diapositivas y lavar 3 veces en 1X PBS durante 5 min, luego 2 veces en agua durante 5 min. Hacer una solución de 3,3 'diaminobencidina (DAB) (véase la Lista de Materiales) y añadirlo a cubrir las secciones. NOTA: Este paso requiere un microscopio para observar óptima detectartiempo de iones de la tinción y se debe hacer para la misma cantidad de tiempo para las diapositivas que deben compararse. Lavar los portaobjetos 3 veces en agua durante 5 minutos cada uno. Deshidratar el tejido mediante la colocación en las siguientes soluciones durante 2 min cada una: 70% de etanol en agua, 95% de etanol en agua, 100% de etanol en agua, 50% de xilenos y 50% de etanol, 100% xilenos. Sellar un cubreobjetos sobre el portaobjetos con un medio de montaje resinoso. Alternativamente, lleve a cabo la tinción de inmunofluorescencia como se describió anteriormente 11 para evaluar gliosis reactiva utilizando anticuerpos contra Iba-1 y GFAP. Tomar imágenes de cada sección de la médula espinal (teñidas con anticuerpos respectivos utilizando DAB) con un 4X, 0,13 objetivo NA y guardar las imágenes como .tiff. Otra opción es tomar imágenes del cuerpo calloso y el haz del cíngulo en el hemisferio cerebral izquierdo o derecho usando un 20X, 0,50 objetivo NA y guardar las imágenes como .tiff. Para una determinación más completa de la carga de lesión en el cerebro, es beneficioso para incluir tanto hemispheres en los análisis. La medición de área media fracción de gliosis reactiva (tinción Iba1 y GFAP) Descargar NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) y abierto en un ordenador. En el software ImageJ, utilizar la cadena de menú Archivo> Abrir y seleccione una imagen desde el paso 4.2.16. Dibuje una zona con "selecciones de polígono" en la barra de menús. Para las médulas espinales, rastrear toda la sección; para el cerebro, el cuerpo calloso y haz cíngulo. Convertir la imagen a 16 bits por ir a Imagen> Tipo y hacer clic en "16-bit". De-ruido de la imagen yendo a procesos> Reste Antecedentes y establecer el "radio de la esfera rodante" a por lo menos el tamaño del objeto más grande que no es parte del fondo (véase la guía del usuario ImageJ en http: //rsbweb.nih .gov / ij / docs / guía / 146-29.html). NOTA: una imagen de Iba 4X-1 tinción Para usamos 4.0 y para GFAP utilizamos 50.0, pero estos números pueden variar en función de ampliación de la imagen y la int tinciónensity. Marque "paraboloide deslizante" y haga clic en "OK". Ir a Imagen> Ajuste> Umbral … y establecer el nivel de umbral más bajo (la barra superior) utilizando las barras deslizantes. Sólo incluir manchando que es celular y ser consistente a través de imágenes. Para las imágenes con un fondo oscuro (sólo se aplica a la tinción fluorescente), asegúrese de que la casilla de "fondo oscuro" está marcada. Ir a Analizar> mediciones indicadas … y seleccione "fracción de área" (da el porcentaje del área de umbral dentro de la región de interés). Asegúrese de que "Límite de umbral" no está marcada y "Mostrar etiqueta" está marcada. Haga clic en "Aceptar" cuando haya terminado. Para obtener mediciones, vaya a Análisis> Medida. Un "Resultados" cuadro emergente aparecerá y estos datos pueden ser guardados como es o copiada en otro programa. Para el análisis, comparación de valores "fracción de área" entre los grupos de tratamiento. La cuantificación de la tinción de MBP por optdensidad de iCal Abrir imagen y dibujar un área de interés tal como se describe en el paso 4.3.1. Ir a Analizar> mediciones indicadas … y seleccione "La media de valor de gris" (la suma de los valores de gris dentro de la selección, dividido por el número de píxeles). Asegúrese de que "Límite de umbral" no está marcada y "Mostrar etiqueta" está marcada. Haga clic en "Aceptar" cuando haya terminado. Para obtener mediciones, vaya a Análisis> Medida. Observe aparece un "Resultados" cuadro emergente. Copiar estos datos y guardar como está o copiar en otro programa. Para el análisis, copiar y pegar valores en otro programa. Convertir el valor de gris medio en la densidad óptica (OD) mediante la fórmula: OD = log 10 (255 / valor medio gris).

Representative Results

En este caso, hemos utilizado dos modelos de EAE para entender si un agente farmacológico proporciona protección al SNC por cualquiera de atenuación de las células T que infiltran el SNC o la prevención de la mielina y daño axonal durante el ataque de la infiltración de células inmunes inflamatorias. Para determinar si un agente terapéutico impide la infiltración de células inmunes en la médula espinal, se utiliza el modelo de ratón C57BL / 6 de la EAE crónica en la infiltración de células inmunes y patología de la enfermedad es predominantemente localizados en la médula espinal (Figura 1A). Para determinar si un fármaco terapéutico proporciona protección SNC durante la intrusión de células inmunes en el SNC, el modelo animal SJL de recaída-remisión EAE se utiliza, lo que demuestra patología de la enfermedad, tanto en el cerebro y la médula espinal (Figura 1B). Las evaluaciones clínicas Evaluaciones clínicas relevantes se hacen de acuerdo a la siguiente escala de calificaciones para típico (Figura 1C) o atípico (Figura 1D) EAE. Para la enfermedad clínica típica, una puntuación de 0 es un comportamiento anómalo. Cuando recogido por la base de la cola, la cola puede girar rápidamente (como un rotor de un helicóptero) y las patas traseras se extenderá aparte. Una puntuación clínica de 1 es una cola parcialmente floja, lo que puede ser determinado por el levantamiento del ratón por la base de la cola. La rotación normal de helicóptero-como puede debilitarse o ausente, y parte de la cola puede ser completamente flojo. Una forma útil para determinar la extensión de la parálisis de la cola es ejecutar un dedo encima de la longitud de la cola, como una cola no paralizados por lo general enrollamiento alrededor del dedo, mientras que una cola parcialmente paralizado será incapaz de hacerlo. Una puntuación clínica de 2 representa una cola completamente paralizado. Ningún movimiento de la cola se produce en absoluto al momento de retirar el ratón hacia arriba en la base de la cola. Una puntuación clínica de 3 representa una parálisis parcial de las extremidades posteriores. La determinación de esta partitura requiere que el ratón sea libre para moverse en un flat superficie. Si una extremidad posterior está arrastrando como el ratón se mueve hacia adelante, o si uno o ambos miembros posteriores parecen ser parcialmente paralizado, una puntuación de 3 se puede dar. Una puntuación clínica de 4 representa la parálisis total de la extremidad posterior. Con este resultado, un ratón no será capaz de mover sus extremidades traseras y arrastrarse hacia adelante con sus extremidades delanteras. Una puntuación clínica del 5 representa un ratón moribundo, o un ratón con dificultad para moverse a través de su propia jaula o la respiración. Si un ratón no puede arrastrarse a lo largo de la parte inferior de la jaula o si su respiración es difícil, el ratón debe ser sacrificado humanitariamente. Una puntuación clínica de 6 representa un ratón encontrado muerto en su jaula. Una puntuación de 6 es inusual y las causas de la muerte que no sea la EAE debe ser investigada. enfermedad clínica atípica puede o no estar acompañada por una parálisis. Puede ser necesario incluir dos sistemas de puntuación separadas si un ratón se presenta con enfermedad atípica más síntomas típicos. Una puntuación de 0 es un comportamiento anómalo, unas con el sistema de puntuación típico. Una puntuación clínica de 1 representa un ligero giro de la cabeza o la inclinación mientras que el ratón está caminando. Esto puede ser determinado por lo que permite el ratón para caminar hacia adelante y la observación de una direccionalidad constante izquierda o derecha para su movimiento. Una puntuación clínica de 2 representa un giro de la cabeza más pronunciada y la poca capacidad de enderezamiento. Al igual que con una puntuación de 1 atípica, el ratón tiene direccionalidad a su movimiento y puede tener una ligera dificultad con el equilibrio. Una puntuación clínica de 3 representa una incapacidad para caminar en línea recta. El ratón tendrá dificultades para equilibrar y puede usar el lado de la jaula para ayudar a derecho en sí mismo, ya que camina. Una puntuación clínica de 4 representa un ratón por su lado, no podía caminar debido a problemas de equilibrio. El ratón puede ser capaz de arrastrar en sí a lo largo de la parte inferior de la jaula, pero puede tener direccionalidad a su movimiento. Una puntuación clínica del 5 representa laminación continua sin sustento. Un ratón que alcanza esta puntuación debe ser humanamente sacrificados. Una clinicaAl puntuación de 6 representa un ratón encontrado muerto en su jaula. Una puntuación de 6 es inusual y las causas de la muerte que no sea la EAE debe ser investigada. Puede que sea necesario para tener en cuenta "en el medio" puntuaciones, por ejemplo, la adición de un 0,5 a un puntaje si cambia el estado de un ratón ligeramente o si la elección entre dos puntajes es difícil. Por ejemplo, un ratón que comienza a moverse más lentamente que sus contrapartes normales, pero no muestra ninguna parálisis o un ratón que abrocha sus patas traseras con su parte delantera en lugar de extendiendo sus piernas al recogerlo por la cola puede dársele una puntuación de 0,5 . Un ratón que sólo pueden arrastrarse a lo largo de la parte inferior de la jaula y sólo es capaz de contraerse sus extremidades traseras periódicamente o cuando se toca puede dársele una puntuación de 3,5. La evaluación de una reducción de la infiltración de células inmune Después de la inducción de EAE en el / 6 modelo de ratón C57BL (Figura 1A, día 0), PRESENTACIÓN antígenoen y la proliferación de las células T en el bazo ocurrir en días 1-5 seguido por infiltración de células inmunes en el SNC alrededor día 7. Aproximadamente 3 a 5 días después de que los ratones infiltración de células inmunes presentes iniciales con las puntuaciones clínicas. Para evaluar si un agente terapéutico es el bloqueo de la infiltración de células inmunes en la médula espinal, las drogas o el vehículo se introducen en el día 7 después de la presentación del antígeno y la proliferación en los bazos pero antes de células inmunes comienzan a infiltrarse en la médula espinal. Si la infiltración de células inmunes se ha atenuado, el curso de la enfermedad clínica debe reflejar la mejora de resultados clínicos durante la fase ascendente de la enfermedad de día 10 a 15 (Figura 2). Una reducción en la infiltración de células inmunes también daría lugar a la disminución de la neuroinflamación. astrocitosis reactiva y microgliosis se consideran las principales características distintivas de la neuroinflamación. La tinción de los astrocitos con GFAP y la microglía con Iba-1 se puede utilizar para evaluar changES en medio de tinción fracción de área para cuantificar la neuroinflamación (Figura 3). Para determinar si se reduce la infiltración de células inmunes, la médula espinal se eliminan y se procesaron para análisis de citometría de flujo en el pico de la enfermedad (Figura 1A, aproximadamente 18 días). Esto asegura que el mayor número de células inmunes han entrado en la médula espinal. Entrada de las células T en el SNC se considera el evento inflamatorio iniciar y ambas células Th1 y Th17 se encuentran en modelos animales de EAE, así como pacientes con EM. Tomados en conjunto, el análisis de citometría de flujo debe incluir la evaluación de ambos tipos de células T patógenas. Además, las células T reguladoras son las células T supresoras bien caracterizado que amortiguan la enfermedad. Por lo tanto, el porcentaje de células T reguladoras de un total de la población CD4 + se debe evaluar en comparación con el porcentaje de poblaciones de células T efectoras. Esto revelará si se ha producido una reducción global de la infiltración de células T o si There es un sesgo de fenotipos de células T en el SNC. Gráficos de puntos representativos (Figura 4A) demuestran una reducción en el número global de CD4 + células T infiltrantes en las médulas espinales de ratones tratados con fármaco en comparación con la médula espinal de los ratones tratados con vehículo (números en los cuadrantes superior derecha). Para evaluar Th1, Th17, y las células Treg se evalúan las siguientes proteínas de la firma: IFN-γ +, IL-17 +, y Foxp3 +, respectivamente, y se debe reducir (Figura 4A). El análisis estadístico se debe realizar en CD4 +, IFN-γ +, IL-17 +, y el número de células Foxp3 + para demostrar una reducción significativa (Figura 4B). Para descartar un sesgo de subconjuntos de células T, evaluación estadística de la proporción de IFN-γ + IL-17 +, IFN-γ + IL-17 -, IL-17 + IFN-γ -, y se lleva a cabo células Foxp3 + ( Fifigura 4C). Para eliminar la posibilidad de que una reducción en el SNC infiltrantes de células T es una consecuencia de la inhibición de la proliferación, activación, diferenciación y en la periferia, el número de la proliferación de células T activa además de la proporción de los subtipos de células T debe ser evaluado. No hay cambio en el porcentaje de CD4 +, IFN-γ +, IL-17 +, o + Foxp3 deben encontrarse si la activación y la diferenciación no se ven afectadas (Figura 5A). Además, no hay cambio en las células Ki67 + CD4 + se debe encontrar si la proliferación no se ve afectada (Figura 5B). Los tratamientos con fármacos se introducen en el día 7 o posterior para evitar la alteración de la presentación del antígeno inicial y activación de las células T en la periferia. Sin embargo, en los modelos genéticos proteínas a menudo se eliminan de forma constitutiva o inducida durante la embriogénesis antes de la inducción de la EAE hacer ASSE esplenocitosssment de gran importancia. La evaluación de la protección del SNC Para demostrar si un agente terapéutico particular modula la patología de la enfermedad en el SNC después de la infiltración de células inmunes, las intervenciones farmacológicas deben administrarse durante el primer pico en la puntuación clínica de la enfermedad. El modelo SJL de la EAE es ventajosa para estos experimentos, ya que estos ratones muestran un fenotipo de recaída-remisión. Si un tratamiento farmacológico previene la degeneración de la mielina del axón, una mejora en las puntuaciones clínicas se observó (Figura 6). evaluación patológica de la mielina debe corroborar una reducción en el daño de mielina consistente con la mejora de las puntuaciones clínicas. Para evaluar cuantitativamente la integridad de la mielina, la tinción DAB de la proteína básica de la mielina (MBP) se lleva a cabo, seguido de un análisis estadístico de la densidad óptica de esta tinción (Figura 7). Para fundamentar aún más que la neuroinflamación está sostenida o disminuido en therapeintervenciones UTIC, gliosis reactiva se pueden evaluar mediante la medición de área media fracción de gliosis reactiva como se ha descrito anteriormente (Figura 3). Para corroborar que una intervención terapéutica es proteger directamente el sistema nervioso central sin efectos inmunomoduladores, la atenuación de la infiltración de células inmunes en el SNC y la proliferación en los bazos se debe descartar. Para hacer frente a esto, los métodos para el cerebro y la evaluación de la médula espinal de la infiltración de células inmunes y la evaluación de la proliferación de células T periféricas y la activación se debe realizar como se describe anteriormente (figuras 4 y 5). Tomados en conjunto, los agentes terapéuticos que bloquean la lesión celular en el SNC sin evidencia de una reducción en el CNS-infiltración de células T o proliferación de células T en la periferia son tratamientos CNS-protectores. Figura 1. Representante Results de las puntuaciones clínicas de EAE en ratones C57BL / 6 y ratones SJL. Las puntuaciones clínicas (A) (media ± SEM) de ratones C57BL / 6 (n = 10) inducida con MOG 35-55 para producir EAE con la enfermedad crónica. (B) Las puntuaciones clínicas (media ± SEM) de ratones SJL (n = 3) inducidas con PLP139b151 para producir EAE con la enfermedad de recaída-remisión. (C) El modelo de puntuación clínica se utiliza para realizar un seguimiento de la progresión de la enfermedad típica en ratones con EAE. (D) El modelo de puntuación clínica se utiliza para realizar un seguimiento de la progresión de la enfermedad atípica en ratones con EAE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Tratamiento farmacológico antes de la infiltración de células inmune en ratones C57BL / 6 con EAE. </strong> Las puntuaciones clínicas (media ± SEM) de C57BL / 6 ratones tratados con PBS (n = 20) o SAS (n = 19) desde el día 7 después de la inmunización con MOG 35-55. Los datos son de tres experimentos independientes reunidas. La diferencia estadística se determinó mediante una prueba de Mann-Whitney de dos colas no paramétrico, * p <0,05. Volver a imprimir con permiso de (11). Figura 3. La tinción de inmunofluorescencia y cuantificación de Gliosis reactiva en la columna vertebral cuerdas de control, EAE, y se trata de C57BL / 6 ratones. (A) etiquetado fluorescente para GFAP (astrocitos) y Iba-1 (microglia) en la médula espinal de control (no inmunizado ratones) (a la izquierda paneles) y ratones con EAE tratados con PBS (paneles intermedios) o SAS (paneles de la derecha). Barra de escala = 100 micras. La cuantificación de la tinción se determinó usando la técnica de fracción de área para medir ciento immunopárea ositive para GFAP (B) y Iba-1 (C). Media ± SEM, n = 3 de control, n = 3 SAS tratos, o n = 4 ratones tratados con PBS, 6 secciones por ratón. Se determinaron las diferencias estadísticas utilizando un ANOVA de una vía, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Vuelva a imprimir con permiso de (11). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Análisis FACS de EAE ratón C57BL / 6 espinal Cordones demostrando reducción de la infiltración de células T en los ratones tratados. C57BL / 6 ratones fueron tratados con SAS o PBS, a partir del 7 d posinducción de la EAE. Las médulas espinales se obtuvieron en el día 15. Los gráficos de puntos representativos (A) mostrar Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) y Th17 (IFN-γ- / + IL-17) en las células CD4 + puerta (paneles superiores) y las células T reguladoras (Foxp3 +) (paneles inferiores). Las gráficas de puntos muestran los porcentajes en el cuadrante superior derecho. (B) se analizaron estadísticamente los números absolutos de células CD4 +, así como IFN-γ +, IL-17A +, y las células Foxp3 +. (C) El cambio en el porcentaje de poblaciones de células T entre SAS- y de los ratones con EAE tratados con PBS también se examinó. Media ± SEM, n = 10 para PBS tratada, y n = 9 para SAS tratada a partir de dos experimentos independientes. Se utilizó la prueba t de dos colas para todos los gráficos de barras. ** P <0,01. Vuelva a imprimir con permiso de (11). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5. FACS Análisis de EAE C57BL / 6 de ratón Los bazos Demostración de los perfiles de expresión de células T equivalente y la proliferación en los ratones tratados y no tratados. Bazos de PBS y los ratones tratados con SAS se analizaron 15 d posinducción de EAE. (A) El porcentaje de células T CD4 +, Th1 (IFN-γ + / IL-17 -), Th17 (IFN-gamma – / IL-17 +) las células reguladoras, y T (Foxp3 +) en los bazos de PBS tratar (n = 10) y tratados SAS (n = 9) los ratones a partir de dos experimentos independientes. (B, panel izquierdo) El porcentaje de células Ki-67 + en la población CD4 + a partir de bazos ingenuos (n = 4), así como de PBS (n = 5) y ratones tratados con SAS (n = 5) inducida con EAE. Una prueba de ANOVA de una sola vía demostró significación estadística entre la proporción de Ki-67 + células de bazo naive en comparación con cualquiera de los bazos de EAE tratados con PBS o SAS. No se observó significación entre PBS y bazos de EAE tratados con SAS. (B, panel derecho) gráficos de puntos representativos; números indican proporción de proliferación. Las gráficas de puntos muestran porcentajes. Los gráficos de barras representan la prueba t de dos colas, *** p <0,001. Vuelva a imprimir con permiso de (11). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6. Tratamiento farmacológico después de infiltración de células inmunes en ratones SJL con EAE. Las puntuaciones clínicas (media ± SEM) de los ratones SJL tratados con PBS (n = 8) o SAS (n = 8) desde el día 24 después de la inmunización (línea discontinua) con PLP 139-151. Los datos son la media ± SEM de las puntuaciones clínicas. La diferencia estadística se determinó mediante una prueba de Mann-Whitney de dos colas no paramétrico, *** p <0,001. La línea superior representa los valores utilizados para la estadísticaanálisis. Volver a imprimir con permiso de (11). Figura 7. La cuantificación de la tinción utilizando MBP densidad óptica. (A) tinción Representante de la PMI en la médula espinal torácica de un ratón knockout genética no especificado en comparación con el control de la misma camada de ratón C57BL / 6 inducida con EAE. Soporte indica área representativa de la tinción reducida MBP desmielinización indica. Tinción (B) MBP de la médula espinal torácica de un knockout genético no especificado C57BL / 6 de ratón. (C) los ratones knockout genéticos no especificados inducidas con EAE (KO; n = 6 ratones, 2-4 lumbar y las secciones torácica por animal) presentan una mayor densidad óptica (OD) de la tinción de MBP en la médula espinal de tipo salvaje (WT; n = 3 ratones, 2-4 lumbar y torácica secciones por animal) ratones inducidos con EAE. USI analizaron estadísticamenteng una prueba t de dos colas, * p <0,05. Las barras de error representan SEM. La barra de escala 100 micras.

Discussion

Los pacientes con EM continúan experimentando recaídas de la enfermedad mientras esté tomando medicamentos que atenúan la activación y / o infiltración de células T en el SNC, lo que justifica el desarrollo de opciones de tratamiento que protegen directamente el sistema nervioso central. EAE clásicamente se ha utilizado para modelar los síntomas de la EM y puede ser una herramienta poderosa en el estudio de la naturaleza de las interacciones entre el sistema inmune y sistema nervioso central in vivo. El uso de la sincronización de las consideraciones de tratamiento en EAE, por ejemplo, antes o después de la iniciación de la enfermedad, en conjunción con el examen de la infiltración de células inmunes en el SNC y la proliferación y activación en la periferia, es posible delimitar los efectos de los tratamientos tanto en el sistema inmune y el SNC.

Mientras EAE en el ratón C57BL / 6 se utiliza más ampliamente, EAE en el ratón SJL puede ser más representativa de la mayoría de los casos de EM, ya que estos ratones tienen un fenotipo de recaída-remisión y la infiltración de células inmunes en el parénquimadel cerebro 10. ratones SJL tienen clara recuperación durante la remisión, así, por lo que es posible comenzar el tratamiento después de la enfermedad se ha presentado, pero en tiempos de disminución de la inflamación. Es importante tener en cuenta que los ratones SJL no siempre recaída y remitir en sincronía, lo que resulta en potencialmente gran variabilidad cuando los resultados se agruparon. Por lo tanto, algunos investigadores pueden optar por mostrar resultados representativos de las puntuaciones clínicas de un animal, teniendo ratones para el análisis FACS e histología en los puntos individualizados en la progresión de la enfermedad.

Teniendo en cuenta cuando se realizan manipulaciones a ratones EAE puede ayudar en la determinación de cómo un tratamiento afecta al sistema inmune o del SNC. Hay muchas opciones para cuando comience el tratamiento, cada una con su connotación de si las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central y la forma en que puede estar interactuando con el sistema nervioso central. Tratamiento antes de inicio de los síntomas implica que las células inmunes aún no han entrado o causado daños en el sistema nervioso central.El tratamiento después de la aparición de los síntomas implica que las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central y han causado algún daño. Utilizando ratones SJL, el tratamiento también puede comenzar durante una recaída, donde las células inmunes se están infiltrando en forma activa y causando inflamación, o durante la remisión, donde las células inmunes pueden ser menos frecuente en el SNC con menos inflamación. hipótesis iniciales con respecto a cómo los tratamientos afectan el sistema nervioso central y el sistema inmunológico se pueden hacer cuando se considera en donde las células inmunes están en el proceso patológico durante el tratamiento.

Hay un número de maneras en las que los tratamientos pueden afectar a las células inmunes y la CNS, cada uno con el resultado final de la reducción de severidad de los síntomas de EAE. Por lo tanto, es necesario el uso de análisis de citometría de flujo e inmunohistoquímica para examinar cómo las células inmunes se ven afectados en la periferia y el SNC, si las células inmunes han entrado en el sistema nervioso central, y cómo el sistema nervioso central reacciona al tratamiento. Mientras que el análisis de citometría de flujo de la médula espinal puede determinar el número de células hahe entrado en el sistema nervioso central en un momento dado, no se puede determinar que este efecto es debido al tráfico de célula inmune reducida a no ser que la proliferación de las células inmunes no se ve afectada en el bazo. Por lo tanto, es necesario analizar tanto el tejido periférico y el sistema nervioso central y determinar qué resultados significan mecánicamente cuando se comparan ambos tejidos. También es posible que los perfiles de actividad de las células inmunes a ser alterados por el tratamiento, por ejemplo con un interruptor en un perfil de células T helper pesada patógena a un perfil de células T reguladoras pesada. En cuanto a los marcadores para los diferentes tipos de células y la comparación de la expresión por ciento entre los animales tratados y no tratados tanto, es también una consideración importante. Un concepto emergente en la investigación MS sugiere que las células B desempeñan un papel importante en la desmielinización autoinmune. Esto se basa en estudios que muestran que las células B son necesarias para la reactivación de las células T 20. Este concepto se apoya en el éxito de los tratamientos como el rituximab, un anticuerpo contra CD20 expresionado en la superficie de las células B 21,22. Como lo demuestra el éxito de la ocrelizumab anticuerpo monoclonal en los ensayos clínicos, las drogas dirigidas a diferentes epítopos del antígeno CD20 pueden mejorar la eficacia de la terapéutica específica de células B-23.

Una de las limitaciones de las técnicas presentadas aquí es que es posible que las células inmunitarias para entrar en el CNS, pero ser incapaces de viajar en el parénquima. La inmunohistoquímica se puede utilizar para detectar manguitos perivasculares de células inmunes y evaluar la distancia recorrida en el parénquima entre los animales tratados y no tratados. Otra posible limitación implica los efectos de la microbioma sobre la EAE patogénesis. Microbiota intestinal comensal puede influir mucho en la patogénesis de enfermedades 24; Por lo tanto, los ratones alojados en diferentes colonias e incluso en diferentes jaulas pueden tener grandes diferencias en la gravedad de la enfermedad. En consecuencia, es preferible siempre que sea posible utilizar los controles de la misma camada criados en la misma jaula paraexperimentos con EAE. Una nota final es que si se trata de forma experimental deseable eliminar los efectos de los cambios proliferativos de células inmunes en la periferia, es posible que se pueda hacer por medio de la inducción de la transferencia pasiva en lugar de la inducción activa descrita en este protocolo.

La confirmación adicional para la neuroprotección se puede lograr utilizando un sistema de co-cultivo 11 para poner a prueba los mecanismos específicos de la muerte celular o a través del uso de ratones knockout condicional que permite la eliminación de las proteínas de forma selectiva en un tipo de célula. Además, para extender la exploración de agentes farmacológicos que son neuroprotectores, los marcadores de la transección axonal y la muerte neuronal deben ser incluidos. Otra área de importancia es la remielinización. axones lesionados son incapaces de mielinizar prestar más apoyo que las terapias neuroprotectoras deben ser una parte importante de las terapias de remielinización. Además, los axones no mielinizados son más vulnerables a las lesiones que myelinaaxones TED. Esto sugiere que cuando un axón se convierte en intervenciones terapéuticas desmielinizadas que promueven la remielinización oportuna impedirá la lesión axonal. Para estudiar estas posibilidades, otros modelos in vivo para la desmielinización y remielinización se pueden utilizar (es decir, cuprizone y lisolecitina). El método descrito en la presente memoria se centró en la evaluación de la neuroprotección mediante la cuantificación de la pérdida de mielina. Para la evaluación de la remielinización del número de células progenitoras, así como su capacidad para proliferar y madurar también sería importante investigar. Con la mención de estos modelos alternativos, se debe considerar también diferentes modelos de encefalitis que están mediadas por virus. Hay dos modelos virales de ARN bien caracterizados que producen la pérdida de la mielina: una es la encefalomielitis murina de Theiler, un virus sin envoltura Picornaviridae, y el otro es el virus de hepatitis de ratón, un miembro de la familia del virus Coronaviridae 25,26.

La EAE es una herramienta valiosa para studies de cómo manipulaciones o tratamientos afectan el sistema inmune y el sistema nervioso central in vivo. El protocolo descrito aquí puede ayudar a determinar donde los tratamientos están afectando el proceso de la enfermedad, ya sea en la periferia, en la barrera sangre-cerebro, o en el SNC. No hay tratamientos actuales para la EM curan la enfermedad y los pacientes a menudo experimentan declive en el tiempo. Del mismo modo, otras enfermedades que implican la infiltración de células inmunes en el SNC y la degradación de la mielina, incluyendo encefalomielitis diseminada aguda, mielitis transversa y la neuromielitis óptica, tratamientos falta que protegen el sistema nervioso central ya que está directamente bajo el ataque de la infiltración de células inmunes. Teniendo en cuenta el tiempo de tratamiento y el uso de análisis de citometría de flujo del bazo y la médula espinal en relación con la inmunohistoquímica de la CNS para evaluar la inflamación y el daño permitirá determinaciones mecanicistas ser realizados en relación con los tratamientos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por el NINDS-P30 NS069324, El Nacional de Esclerosis Múltiple SocietyRG 4587-A-1, La Fundación Internacional de Investigación Civitan, La Fundación Mike L. Jezdimir mielitis transversa, La Fundación Universidad de Alabama Servicios de Salud – Fondo General de Dotación, El Nacional Science Foundation 1355183 y T32 AI007051 del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los Institutos nacionales de Salud.

Materials

22 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9719245
22 x 30 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9531194
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific  21985-023
2-Methylbutane Fisher Scientific O3551-4
30 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific 18-30
ACK Lysing Buffer Quality Biological 118-156-101
anti-CD4 PE-Cy7 BD Biosciences 552775 0.2 mg/mL stock concentration
anti-Foxp3-FITC eBioscience 11-5773-82 0.5 mg/mL stock concentration
anti-GFAP (Cocktail) Biolegend 835301 1-3 mg/mL stock concentration
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug) Wako 019-19741 0.5 mg/mL stock concentration
anti-IFN-γ APC eBioscience 17-7311-82 0.2 mg/mL stock concentration
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-7177-82 0.2 mg/mL stock concentration
anti-Ki-67 PE eBioscience 12-5698-82 0.2 mg/mL stock concentration
anti-MBP (D-18) Santa Cruz Biotechnology sc-13912 0.2 mg/mL stock concentration
anti-TCRβ FITC eBioscience 11-5961-85 0.5 mg/mL stock concentration
anti-TCRβ PE eBioscience 12-5961-83 0.2 mg/mL stock concentration
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Vector Labs BA-1000 1.5 mg/mL stock concentration
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG Vector Labs BA-2000  1.5 mg/mL stock concentration
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% Fisher Scientific AC42356-5000
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% Fisher Scientific AC446085000
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 Fisher Scientific 12-550-15
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00 ​Foxp3 transcription factor staining reagents
Golgi Plug BD Biosciences 555029 protein transport inhibitor
Immedge Hydrophobic Barrier Pen Fisher Scientific NC9545623
Ionomycin EMD Millipore 407952-5mg
L-Glutamine, 100X Corning 25-005-Cl
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-Cl
Near IR Live/Dead Staining Kit Life Technologies L10119 viability dye
Normal goat serum Vector Labs S-1000
Normal horse serum Vector Labs S-2000
Paraformaldehyde, 96% Fisher Scientific AC416785000
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-Cl
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 density gradient
Permount Fisher Scientific SP15-500 resinous mounting medium
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1mg
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody BioLegend 808401
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
Sodium Pyruvate Corning 25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 nonionic detergent
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) Fisher Scientific NC9206402 avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase 
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) Fisher Scientific NC9276270 DAB solution
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References

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Evonuk, K. S., Moseley, C. E., Doyle, R. E., Weaver, C. T., DeSilva, T. M. Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination. J. Vis. Exp. (115), e54348, doi:10.3791/54348 (2016).
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