自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

マウスを含む実験手順は、関連機関や政府の規制を遵守しなければなりません。本研究では、マウスを収容し、バーミンガム制度動物実験委員会のガイドラインで健康とアラバマ大学の国立研究所に従って処理します。 1. EAE誘導およびスコアリング以前13に記載のようにC57BL / 6マウス11-13またはSJLマウス10,11にEAEを誘導します。 注：実験者が自分の研究課題（さらに詳細のための議論を参照）のためのモデルの理想を選択する必要があります。 レコードのスコアは、毎日のように、以前の7日誘導後に始まる各マウスについて11を説明しました。治療群間の時間をかけて一日平均スコアを比較します。 2.治療治療は、免疫細胞の浸潤や増殖に影響を与えるかどうかを判断するために、疾患の発症前に、EAEマウスを扱います。 治療を選択して、私送達THOD、および治療の頻度、薬物の血液脳関門透過性、半減期、および投薬量を考慮しています。 注：EAEは、血液脳関門の透過性を増加させ、薬物はそうでなければ健康な動物におけるできないCNSに到達することを可能にします。 EAEの臨床スコアを見て用量反応曲線のための実験を​​実施することは、薬物の適切な用量を選択する際に役立つことがあります。ビヒクルコントロールは、薬物処理を並行して実行されるべきです。あるいは、条件付きノックアウトマウスは対照として同腹子と共に使用することができます。 この実験のためSJLまたはC57BL / 6マウスを使用してください。配達の選択した方法を用いて、症状の発症前に、早期にEAE誘導（7日目）後のマウスを扱います。 生け贄に捧げるとステップ3.1と時間をかけて最高の臨床スコアの平均に基づいて、そのサブステップ、のように、疾患のピーク（約15日目）にマウスを解剖。 行動は、免疫細胞infiltratiを決定する（ステップ3.2のように）マウスの脊髄にフローサイトメトリーCNSの上、及び末梢における免疫細胞の増殖を決定する（ステップ3.3のように）脾臓に。独立したマウスでは、アストロサイトとミクログリア、及びミエリンの保存を定量化する（ステップ4のように）免疫組織化学を行っています。 免疫細胞の浸潤が発生した後に治療がCNSを保護するかどうかを判断するために、疾患の発症後EAEマウスを扱います。 手順を繰り返し2.1.1。 これらのマウスは測定可能な疾患の寛解を持っているように、この実験のためにSJLマウスを使用してください。平均臨床スコアによって測定されるように（以下再発のピーク時に、必要に応じて、または）疾患の最初のピーク時にマウスを扱います。 所望の時間の後のEAE誘導でマウスを生け贄に捧げます。浸潤が既に発生しているため、FACS分析によって浸潤を測定するために有用ではないかもしれません。しかし、免疫細胞の浸潤にもかかわらず、中枢神経系の保護があるかどうかを判断するために、反応性グリオーシスおよびミエリンを定量化するために脊髄を取ります。 3.フローサイトメトリー分析解剖動物のIDや組織の種類と動物当たりラベル3 15ミリリットルコニカルチューブ（脳のための1つ、脊髄のための1つ、および脾臓のための1つ）が含まれます。氷の上で全体の手順のために別々のチューブ内のすべての組織を保管してください。 3分 – 脾臓のFACS分析のために、2分ごとに約15％の容器の容積の流量で二酸化炭素を用いて疾患（〜15日後のEAE誘導）のピーク時に、マウスを屠殺。呼吸の欠如によって安楽死を確認してください。各マウスの犠牲に続いて、個々に脾臓14と場所を削除し、氷冷RPMI、2％FCS、100 IUのペニシリン、および100μg/ mlのストレプトマイシンを補充含む（ステップ3.1.1から）15ミリリットルコニカルチューブを標識しました（プロトコルを通じて「メディア」）と呼ばれます。 脳および脊髄のFACS分析のために、circulatinを解放するために、外科用はさみを用いて、マウスの右心房を切断することによって心臓の灌流を行いますグラムの血液や氷冷PBS 10mlで充填されたシリンジに接続された針を左心室を貫通します。ゆっくりと10mlのPBSを注入。 マウスの頭部を切断し、手術用ハサミで頭皮の正中線をカットします。ピールは、手の甲によるまたは鉗子で皮膚を出発点として、脊髄のエントリポイントを使用して、手術用ハサミで頭蓋の正中線をカットします。 マイクロ鉗子で頭蓋骨を剥がすと脳を解放するためにスコップを使用しています。 （ステップ3.1.1から）標識された15ミリリットルコニカルチューブを含有する培地に脳を置きます。 鉗子および外科はさみでマウスの皮膚を除去し、手術用はさみを使用して、マウスを骨抜き。手足、尾、肋骨を切断し、手術用ハサミで任意の周囲の筋肉が脊柱を解放します。 手術用ハサミで約5ほぼ等しい片に脊柱をカット​​し、止血剤と一体の一端を圧迫し、その後、別の止血トンを使用O脊髄は、上部から圧搾するまで一片に沿って移動し、圧搾続けます。脊柱の各部分のためにこれを繰り返して、個々にコードを配置し、メディアを含む15ミリリットル（ステップ3.1.1から）円錐管を標識しました。 脳および脊髄における免疫細胞浸潤の評価滅菌はさみを使用して小片に、脳と脊髄をカットします。メディアとのストレーナをすすぎながら、新しい50ミリリットルチューブに70μmのセルストレーナーの上に3ミリリットルシリンジからプランジャーでつぶします。メディアで50mlの体積に各チューブを持参してください。ペレット細胞に5分間、453×gで遠心分離します。 40％の密度勾配媒体の4ミリリットルで上清を吸引し、ペレットを再懸濁し。慎重勾配の適切な階層化を確実にするために、円錐管の壁に非常にゆっくりと新しい15ミリリットルコニカルチューブ、ピペットで70％の濃度勾配の2ミリリットルの上に細胞を含有する40％の濃度勾配を重ねます。で室温で20分間、796×gでスピンブレーキアウト。 慎重に、1ミリリットルの転送ピペットを用いて勾配から上位ミエリン層を除去し、新しい15ミリリットルコニカルチューブに1ミリリットルホールピペットと転送に界面で生細胞を除去します。 10分間、448×gでメディアや遠心分離機で15ミリリットルにチューブを持参してください。 再懸濁し、200μlの培地中のペレットと（各動物からの各サンプルは、独自のウェルになります）を、96ウェル丸底プレートの1ウェルに配置します。 5分間、410×gでプレートを遠心。 再刺激培地200μl中上清及び再懸濁ペレットをオフフリック（RPMI、10％FCSを補充し、100 IU / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、1×非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、およびβメルカプトエタノール55μM、プラス50 ngの/ mlのホルボールミリステートアセテート（PMA）、750 ngの/ mlのイオノマイシン、およびタンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンA）。 4時間37°Cのインキュベーターでプレートを置きます。 注：PMAとionom全てのTリンパ球に関係なく、その抗原特異性の所定の組織内の各T細胞サブセットの数を評価するための活性化ycin再刺激をもたらします。しかし、抗原特異的エフェクターT細胞応答は、ブレフェルジンA 15,16の存在下で、MOGペプチドを用いて細胞を再刺激を含む種々の方法で評価することができます。 CNS CD4 + T細胞の表現型の評価インキュベーションに続いて、5分間、410×gで遠心分離する（ステップ3.2.5から）を、96ウェル丸底プレート、上清をオフフリック。次の染色工程の全ては、このプレートで行われます。 5分間、410×gで2％FCSおよび遠心分離機で200μlのPBSで細胞を洗浄します。上清オフフリックと10のためのFcブロック（クローン2.4G2）で2％FCSを含む200μlのPBSで細胞をインキュベート – 氷の上で15分。 50で、5分間、410×gで上清オフフリック、およびペレットを再懸濁し、細胞外染色、遠心細胞を開始するには＆＃956;表面染色カクテルL（1：200、を1μg/ ml）のCD4に対するフルオロフォア標識された抗体を含む、TCRβ15のためにPBS中に希釈し（1：200、を1μg/ mlで）、および生存率染料（500 1）氷上で分。上清オフ5分とフリックのための410×gで遠心分離細胞。ウォッシュ次いで、細胞を5分間、410×gで遠心分離し、200μlのPBSで2倍。 細胞外の汚れを除去した後、細胞内染色に続いて、固定/透過処理による細胞内染色手順を開始します。 （製造元の指示に従って、物質一覧を参照してください）17を 、開始上清オフフリックとのFoxp3転写因子染色試薬で/透過処理細胞を修正するには30分4 O℃で一晩のために 5分間、410×gでキットと遠心プレートから150μlの透過化バッファーで細胞を洗浄します。 IL-17Aに対するフルオロフォア標識抗体を用いた50μlの透過化バッファーで上清と染色細胞オフフリック（1：200、を1μg/ ml）を、IFN-γ（1：200、を1μg/ mlで）、およびFoxp3を（1：200、2.5μgの/ ml）を、氷上で30分間、PBSで希釈しました。 上清オフ5分とフリックのための410×gで遠心分離細胞。過剰な抗体は、その後5分間410×gで遠心分離200μlの透過化バッファーで3回洗って削除します。 200μlのPBS中の上清および再懸濁をオフにフリック。 以前に各分子を発現する細胞の割合を評価するために11の記載のように、ライブCD4 +TCRβ+細胞上でゲーティング、フローサイトメトリーによって細胞を分析します。 CD4 + T細胞の表現型のそれぞれにマウスあたりの細胞数を決定するために、血球計数器18又は他の検証方法を用いて細胞を数えます。 得られたデータを用いて、特定のEAEの病因に重要な役割を果たし、これらの集団の中心と保護を、各マウスから脳と脊髄を浸潤するCD4 + T細胞の割合および数を計算19：IL-17A + IFN-γ – 、IL-17A + IFN-γ+、IL-17A – IFN-γ+、Foxp3を+。 末梢T細胞の増殖および活性化の評価 60×15ミリメートル培養皿にすりガラスのスライドで脾臓をつぶします。細胞を懸濁するためにメディアを使用して、15ミリリットルコニカルチューブに細胞懸濁液を置きます。 5分間、448×gでメディアや遠心細胞を15ミリリットルにチューブを埋めます。 2ミリリットル中の培地を吸引し再懸濁ペレットは、ACK約3分間赤血球を溶解するために室温で溶解緩衝液。 新しいチューブに70μmのセルストレーナーを介してメディアや株と15ミリリットルボリュームにチューブを持参。 5分間、448×gで遠心分離細胞は、2ミリリットルのメディアに上清、再懸濁を吸引。 Ki-67染色による末梢CD4 + T細胞増殖の評価 EQの少量（典型的には200μl）を配置します96ウェル丸底プレートの個々のウェルに3.3.3からの脾細胞のuivalent数（サンプルあたり1）。 上清オフ5分とフリックのための410×gで遠心分離します。 200μlのPBSで再懸濁し、2％FCSを含有し、遠心分離を繰り返します。 PBSは、Fcをブロック（クローン2.4G2）で2％FCSを含有する上清および再懸濁細胞をオフにフリックし、10インキュベート – 氷の上で15分。細胞外染色リピートステップ3.2.6.3ください。 細胞外の汚れを除去した後、細胞内染色に続いて、固定/透過処理による細胞内染色手順を開始します。 手順を繰り返し3.2.6.4.1。 上清オフ5分とフリックのための410×gで遠心分離細胞。洗浄細胞を5分間410×gでキットや遠心分離機から200μlの透過化バッファーで1倍。 30分間：（200、1 / mlの1）抗のKi-67抗体を用いて50μlの透過化バッファーで上清と染色細胞オフフリック。 410×gでのfoで遠心分離した細胞上清オフR 5分とフリック。洗浄細胞を5分間410×gでキットや遠心分離機から200μlの透過化バッファーで2倍。 上清をオフにフリックおよび洗浄細胞を200μlのPBSで1倍と5分間、410×gで遠心。以前パーセントのKi-67 +細胞を評価した後、11を説明したように、ライブCD4 +TCRβ+細胞にゲーティング、フローサイトメトリーにより細胞を分析します。 末梢CD4 + T細胞の表現型の評価 5分間、410×gで96ウェル丸底プレート（サンプルあたり1ウェル）、遠心分離器に（ステップ3.3.3から）の細胞を200μlを置き、3.2.5のように再刺激します。 4時間37°Cのインキュベーターでプレートを置きます。ステップ3.2.6とそのサブステップと同じ染色手順を実行します。 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5のようにフローサイトメトリーにより細胞を分析します。 4.免疫組織化学ANDの定量組織標本 C57BL / 6マウスのための疾患の慢性期またはの平均臨床スコアのピーク時に、EAE誘導（しばしば〜30日後の任意の時点で別のステップ3で使用したものから、実験とそのサブステップでEAEマウスを生け贄に捧げますSJLマウス）反応性神経膠症および脱髄の程度を決定するために、以下の手順で。 2.5％イソフルランと97.5％の酸素でマウスを麻酔し、応答の欠如を探して、ピンセットを用いて穏やかなつま先のピンチで麻酔の適切な深さを確認します。ステップ3.1.3で説明したように経心臓灌流を行います。左心室にPBSを注入した後、PBS 注意に4％パラホルムアルデヒドの10ミリリットルを注入するために、新しい注射器を使用します 。パラホルムアルデヒドは皮膚及び肺刺激物である、目に重大な損傷を引き起こす可能性があり、および発がんのおそれの疑いがあります。吸入、経口摂取を避け、皮膚や目に接触。灌流は、ドラフト内で行うべきです。 </李> 3.1.6 – 手順3.1.4で説明したように、脳や脊柱を削除してください。脊髄のまっすぐな位置合わせを確実にするために文字列を使用してスティックにせき柱を接続します。 50ミリリットルでシンチレーション約20mlのPBS中4％パラホルムアルデヒドので動物のIDで標識されたバイアル、および脊髄に脳を入れて一晩-修正を投稿する約50mlのPBS中4％パラホルムアルデヒドので動物のIDで標識された円錐管。 脳をcryoprotectするには、1×PBS中の30％スクロース中4 O℃で1×PBSと店舗で3回すすいでください。脳はそのコンテナ（約3日間）の底に落下することを可能にします。 10〜となります1×PBSで3回洗浄し、pHを開始し、1×PBS中の0.5 M EDTAの大容量（マウスの脊髄では約50ミリリットル）（に置くことで脊柱からカルシウムを削除し、pHがに〜7.8骨はもはや剛性になるまで3週間 – 2のための6NのHCl）を持ちます。ステップ4.1.5に従うことによって脊柱をCryoprotect。 埋め込み脳とすぐに彼らは、容器の底に落下として、以下のサブステップを、次の10月中にせき柱。 1×PBS中の1部の30％スクロースおよび2部10月の混合物を作る（例えば、1×PBS中で15ミリリットルの30％ショ糖を追加する30ミリリットル10月）。 それはフルの約1/2になるまで埋め込む金型（22×22のx 20ミリメートル、脳および脊髄のための22×30×20ミリメートル）に10月/ショ糖混合物を追加します。 カミソリの刃を使用して、6均等サイズのピースに脊柱をカット​​し、冠状脊髄切片のために前方を向いた22×30×20ミリメートルの埋め込み型内に配置します。前方を向いた22×22×20ミリメートルの金型に脳全体を置きます。 組織をカバーし、それが1時間放置する10月/ショ糖混合物を追加します。そのように気泡が逃げることができます。この時間の間に、フラッシュ凍結用包埋金型を保持することができ皿に2メチルブタンを追加します。ドライアイス上に皿を置き、クール事前にカバーしています。 交流の内部-80 O Cでドライアイスとストアの2-メチルブタンで金型をフラッシュ凍結脱水を防ぐためにontainer。 クライオスタットと16ミクロンで準備ができたら、セクション組織と静電的に帯電したスライド上にマウントします。各脳や脊髄のためのスライド上のすべての10 番目のセクションを入れて（例えば、というように1は、セクション1、11を持ってスライドさせ、21、およびセクション2、12を持っています2をスライドさせ、22、および）。ストアは-80 O Cでスライドするか、染色のためにすぐに使用しています。 反応性神経膠症およびミエリンの染色準備ができたら染色のため、同じ（またはできるだけ同じ）領域内のすべての動物のために染みあたりの脳と脊髄のための1つのスライドそれぞれを選択します。脳は、脳梁と帯状束の束を示すスライドを選択します。 場所は、7分間70°Cのでヒートブロック上の組織にスライドします。 7分後、ヒートブロックをオフにして、スライドを別の10のためのヒートブロック上で冷ます – 15分。これは、染色手順中にスライド脱落組織切片を防止します。 洗浄は5分間（表面抗原を標的とする抗体用）（細胞内抗原のための）0.1％非イオン性界面活性剤または1x PBSで1×PBSで3回ずつスライドします。 注：このプロトコルで使用される抗体は細胞内であるため、非イオン性界面活性剤は、後続のステップで使用されます。スライドがこのステップの後、完全に乾燥させることはありません。 コンテナ内のスライドを置き、クエン酸緩衝液pH3.0でカバーしています。クエン酸緩衝液を作るために、水に100ミリリットルの最終容量に0.192グラムの無水クエン酸を追加します。以下の場合にはpHが3.0又はNaOHの上にあれば、酢酸でpHを調整します。 30分間、37°C ​​の時のスライドをインキュベートし、5分間、0.1％の非イオン性界面活性剤と1×PBSで3回洗浄します。 サークル疎水性バリアペンで組織の周囲の領域と、加湿チャンバー内でスライドを配置（例えば、湿ったペーパータオルを含むスライドボックス）。組織にブロッキングバッファーを追加します。室温で30分間インキュベートします。 注：バッファをブロックすると、1×PBSで構成されてい0.3％非イオン性界面活性剤及び二次抗体、 すなわち 、IBA1ためのミエリン塩基性タンパク質（MBP）およびグリア細胞繊維性酸性タンパク質（GFAP）、及びヤギ血清用のウマ血清のホストに基づいて、適切な血清（5％）を加えました。 スライドをバッファ・オフし、一次抗体を追加遮断フリック（1：1,000またはオリゴデンドロサイトのために0.2μg/ mlのヤギ抗ミエリン塩基性タンパク質、1：アストロサイトのための千または1 / mlの3 / mlのマウス抗GFAP、または1 ：750または適切なブロッキング緩衝液で希釈し0.67 / mlのウサギミクログリアのための抗IBA1）（丸で囲んだ領域へのステップ4.2.6）を参照してください。加湿チャンバー内の4 Oの Cで一晩おきます。 スライドをバッファ・オフし、5分間、0.1％の非イオン性界面活性剤と1×PBSでスライドを3回洗浄ブロッキングフリック抗体。 二次抗体を加える（1：200またはMBPおよびGFAP、またはビオチン化ヤギIBA1抗ウサギ7.5 / mlのビオチン化ウマ抗マウス）適切なブロッキング緩衝液で希釈した（STE丸で囲んだ領域にP 4.2.6）、室温で1時間、加湿チャンバー内でインキュベートするスライドを残します。 スライドをバッファ・オフし、5分間、0.1％の非イオン性界面活性剤と1×PBSでスライドを3回洗浄ブロッキングフリック抗体。 使用前に免疫におけるアビジン – ビオチン – ペルオキシダーゼ複合体（ABC）（素材リストを参照してください）​​30分を準備し、4.2.12で必要になるまでシェーカー上で攪拌します。内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし、10分間円で囲まれた領域に、メタノール中0.3％H 2 O 2を加えます。 スライドオフフリック液とは、1×PBS中で、その後、5分間、0.1％の非イオン性界面活性剤での1×PBSまたは1x PBSで2回に1回洗います。 30分間の円内にABC試薬を追加します。 5分間水中でフリックスライドオフ溶液と5分間、1×PBSで3回洗浄し、次いで2回。 3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を作製（材料リストを参照）、セクションをカバーするためにそれを追加します。 注：このステップでは、検出に最適な観察する顕微鏡が必要です染色とのイオン時間を比較するスライドのために同じ時間に実行する必要があります。 洗浄は、5分ごとに水で3回スライド。水中の70％エタノール、水で95％エタノール、水で100％エタノール、50％のキシレンおよび50％エタノール、100％キシレン：2分ごとに、以下の溶液中に置くことによって、組織を脱水します。樹脂製のマウンティング培地でスライドにカバースリップをシール。 以前伊庭-1およびGFAPに対する抗体を用いた反応性神経膠症を評価するために11を説明するように別の方法として、免疫蛍光染色を行います。 4X、0.13 NAの対物レンズで（DABを用いて、各抗体で染色）各脊髄部分の画像を撮影し、.TIFFとして画像を保存します。また、20X、0.50 NAの対物レンズを用いて、左または右の脳半球における脳梁と帯状束バンドルの画像を撮影し、.TIFFとして画像を保存します。脳内の病変の負荷のより包括的な決意するためには、両方のhemispherを含むことが有益です分析でエス。 反応性神経膠症についての平均分数の面積を測定（IBA1およびGFAP染色） ダウンロードNIH ImageJの（http://imagej.nih.gov/ij/）とコンピュータで開きます。 ImageJソフトウェアでは、メニューの文字列ファイル]> [開く]を使用して、ステップ4.2.16から画像を選択します。メニューバーの「ポリゴンの選択」ツールを使用して領域を描画します。脊髄については、セクション全体をトレースします。脳、脳梁と帯状束バンドルのため。イメージ>タイプに行くと、をクリックすることで16ビットに画像を変換する「16ビット」。 プロセスに行くことによって脱ノイズ画像>（HTTPでImageJのユーザーガイドを参照してください背景を引き、バックグラウンドの一部ではない最大のオブジェクトのサイズ以上に「 ローリングボール半径」を設定します。//rsbweb.nih .GOV / IJ /ドキュメント/ガイド/ 146-29.html）。 注：伊庭-1染色の4X画像の場合、我々は4.0を使用し、GFAPのために、我々は50.0を使用しますが、これらの数字は、像倍率と染色int型に応じて変えることができますensity。 「スライディング放物面」をチェックし、「OK」をクリックします。 >しきい値を調整>画像へ…スライドバーを使用して、より低い閾値レベル（トップバー）を設定します。携帯でのみ染色を含めると、画像で一致しています。暗い背景（のみ蛍光染色に適用されます）との画像については、「ダーク背景」ボックスがチェックされていることを確認してください。 >セットの測定を分析するために行く…と選択「エリアフラクション」（関心領域内の閾値処理面積の割合を示します）。 「しきい値リミット "をチェックしないと「表示ラベル」がチェックされていることを確認してください。完了したら「OK」をクリックしてください。 測定値を得るために、>メジャーを分析しに行きます。 「結果」のポップアップボックスが表示され、このデータは別のプログラムにあるとして保存またはコピーすることができます。分析のために、治療群間の「面積率」の値を比較します。 オプトによってMBP染色の定量化iCalの密度開いている画像とステップ4.3.1で説明したように関心領域を描きます。 >セットの測定を分析するために行く…と選択します（ピクセル数で割った選択範囲内のグレー値の合計） "グレー値を平均」。 「しきい値リミット "をチェックしないと「表示ラベル」がチェックされていることを確認してください。完了したら「OK」をクリックしてください。 測定値を得るために、>メジャーを分析しに行きます。 「結果」のポップアップボックスが表示されます確認します。このデータをコピーし、保存しているとして、または別のプログラムにコピーします。 分析のために、別のプログラムにコピー＆ペースト値。 OD = 10ログ（255 /グレー平均値）：式を用いて光学密度（OD）に平均グレー値に変換します。