This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.
A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.
טרשת נפוצה (MS) מאופיין נגעים דלקתיים בעיקר באזורי חומר לבנים של המוח כבר בשלב מוקדם. אחרי התקדמות לטווח ארוך, ניוון החומר האפור הוא זוהה על ידי הדמיה MRI ומסמן את השלב ניווניות של המחלה. דבקת תגובתי, פגיעה במיאלין, ונזק אקסונלית בחומר הלבן מיוחסות CNS-שחדר תאי חיסון. אף אחד מהטיפולים המשמשים כיום MS הפוכה או ישירות למנוע ניוון מוחיים של מערכת העצבים המרכזית – במקום זאת, הם להפחית את הדלקת על ידי הפחתת הפעלת תא T ו / או חדירה לתוך מערכת העצבים המרכזית. כי אין תרופה לטרשת נפוצה למטופלים בעזרת טיפולים שוטפים ממשיכים לחוות את התקדמות מחלה, תגליות של תרופות המונעות אובדן demyelination ו עצבי חשובות באופן קריטי. עם זאת, הבחנה בין השפעות על תאי מערכת החיסון לבין אלה על מערכת העצבים המרכזית יכול להיות קשה נסיוני, כמו התוצאה – כלומר, נזק מופחת של מערכת העצבים המרכזית – נראה same תלות המנגנונים שבאמצעותם היא מתרחשת. לכן, הערכה של גינת CNS חייבת להיות שותפות עם ערכות של CNS-שחדר תאים חיסוניים ושגשוגם של תאים חיסוניים בפריפריה כדי לקבוע כיצד תרופתי סוכנים להשפיע מנגנוני מחלה.
Encephalomyelitis אוטואימוניות ניסויי (EAE) הוא מודל חי מבוסס היטב של מחלות דלקתיות אוטואימוניות כי היו אחראי ישירות על גילוי תרופות המשמש כיום לטיפול בטרשת נפוצה 1-4. עכברים משמשים לעתים קרובות EAE, עם C57BL / 6 עכברים להיות זן פופולרי מבוסס על הזמינות של וריאנטים גנטיים. C57BL / 6 עכברים מושרים עם EAE להפגין התקדמות מחלה כרונית עם הופעה כ -10 יום-אינדוקציה פוסט. הסתננות של parenchyma חוט השדרה ובמוח הקטן אופיינית histopathology של החיות האלה, עם העדר החדיר של parenchyma קליפת מוח 5. בנוסף, נגעים קורטיקליים demyelination ב bגשם הם מסימני ההיכר של המחלה 6-9, אשר נעדרים יחסית C57BL / 6 עכברים. לכן, זה עשוי להיות עדיף במידת האפשר להשתמש בעכברים SJL, אשר יש בשלב ההתקפי המחלה ונגעים נמצא בשני במוח ובחוט השדרה שנראים דומים לאלה ב- MS 10.
טיפול יכול לא להיות מסווג נוירו אם תאי מערכת חיסון לא להגיע CNS. לכן, בפרוטוקול זה עושה שימוש ניתוח תזרים cytometric של המוח, מיתרי השדרה, ו טחול מעכברים EAE לקבוע השפעות הטיפול על חדירת תאים חיסוניים לתוך מערכת העצבים המרכזית ואת התפשטות של תאים חיסוניים בפריפריה, כמו בעבר הפגינו 11. ניתוחים immunohistochemical של רקמת מערכת העצבים המרכזית לקבוע היקפו ואופיו של neuroprotection מתואר גם. שילוב שיטות אלה מאפשר אינדיקאטורים לצורך הבחינה האם תאי חיסון הופעלו התרבו בפריפריה, אם תאי מערכת החיסון נכנס CNS, והאם CNS היה protected מדלקת או נזק. אם תופעות נוירו נחשדים למרות השפעות על מערכת החיסון, הנסיינים יכולים לשנות את שיטת הטיפול להתחיל פעמים לאחר חדירת תא החיסון לתוך מערכת העצבים המרכזית התרחשה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול תוך שימוש בשני מודלים שונים של EAE פעיל, במודל חיה T התא בתיווך של MS, ניתוח תזרים cytometry בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה ב שונות בזמן נקודות במהלך המחלה כדי לקבוע את היעילות של טיפולים ניסיוניים על היבטים שונים של בפתוגנזה MS. שיטה זו תסייע לחוקרים להבדיל בין השפעות על התפשטות תאי חיסון וחדיר מול גינת CNS, מה שמקל כדי לצמצם עד כמה תרופות לפעול על בהיווצרות מחלה.
חולי טרשת נפוצה ממשיכים לחוות הישנות המחלה בזמן נטילת תרופות כי להחליש הפעלת תא T ו / או חדירה לתוך מערכת העצבים המרכזית, המחייב לפיתוח אפשרויות טיפול ישירות להגן על מערכת העצבים המרכזית. EAE נעשה שימוש קלאסי למדל את הסימפטומים של טרשת נפוצה יכול להיות כלי רב עוצמה כאשר לומדים את מהות יחסי הגומלין בין המערכת החיסונית לבין מערכת העצבים המרכזית in vivo. שימוש עיתוי שיקולים טיפול EAE, למשל, לפני או לאחר תחילת המחלה, בשילוב עם בדיקת חדירה תא החיסון של מערכת העצבים המרכזית ואת התפשטות והפעלה בפריפריה, אפשר לשרטט את ההשפעות של טיפולים הן על המערכת החיסונית מערכת העצבים המרכזית.
בעוד EAE בתוך העכבר C57BL / 6 מנוצל באופן נרחב יותר, EAE בתוך העכבר SJL עשוי להיות יותר נציג ברוב המקרים MS, כמו שיש עכברים אלה פנוטיפ בשלב ההתקפי וחדירה של תאים חיסוניים parenchymaשל המוח 10. עכברים SJL יש התאוששות ברורה במהלך רמיסיה כמו גם, מה שהופך אותו ניתן להתחיל טיפול אחרי גילוי המחלה שהוצגו אבל בזמנים של הפחיתו את הדלקת. חשוב לקחת בחשבון כי עכברים SJL לא תמיד להישנות לפרוע בתיאום, וכתוצאה מכך השתנות פוטנציאל גדול כאשר התוצאות הם אספו. לכן, כמה חוקרים יכולים לבחור להציג תוצאות נציג ציונים קליניים בבעלי אחד בזמן נטילת עכברים לניתוח FACS היסטולוגיה בנקודות אישיות בהתקדמות המחלה.
בהתחשב כאשר מניפולציות נעשות לעכברים EAE יכול לסייע בקביעת איך הטיפול משפיע על מערכת החיסון או מערכת העצבים המרכזית. ישנן אפשרויות רבות כאשר הטיפול מתחיל, כל אחד עם קונוטציה משלה אם תאים חיסוניים נכנסו CNS וכיצד הם עשויים להיות באינטראקציה עם מערכת העצבים המרכזית. טיפול לפני הופעת התסמינים מרמז כי תאי חיסון טרם הזנת או גרמו נזק למערכת העצבים המרכזית.טיפול לאחר הופעת התסמינים מרמז כי תאי חיסון נכנסו CNS וגרמו נזק. שימוש בעכברים SJL, הטיפול יכול גם להתחיל במהלך להרע, שם בתאי חיסון שחדר פעיל גרימת דלקת, או במהלך רמיסיה, שבו תאי מערכת החיסון עשוי להיות פחות נפוץ במערכת העצבים המרכזית עם דלקת פחות. השערות ראשוניות בנוגע לאופן טיפולים משפיעים על מערכת העצבים המרכזית ואת מערכת החיסון יכול להתבצע כאשר שוקלים היכן תאי מערכת החיסון נמצאים בתהליך הפתולוגי במהלך הטיפול.
ישנן מספר דרכים בהן טיפולים יכולים להשפיע תאים חיסוניים CNS, כל אחד עם התוצאה הסופית של הפחתת חומרת הסימפטומים EAE. לכן, יש צורך להשתמש בניתוח תזרים cytometric אימונוהיסטוכימיה להסתכל איך החיסונית התאים מושפעים בפריפריה CNS, אם תאים חיסוניים נכנסו CNS, וכיצד מערכת העצבים המרכזית מגיב לטיפול. בעוד ניתוח תזרים cytometric של חוט השדרה יכול לקבוע כמה תאים חההזנו את מערכת העצבים המרכזית בכל זמן נתון, לא ניתן לקבוע כי השפעה זו נובעת סחר תא החיסון מופחת אלא התפשטות של תאי מערכת החיסון אינה מושפעת בטחול. לכן, יש לנתח הן רקמות הפריפריה CNS ולקבוע לאילו תוצאות מתכוון מכניסטי כאשר הן רקמות מושווים. אפשר גם עבור פרופילי פעילות התא החיסון כדי להשתנות על ידי טיפול, למשל שיש מתג בפרופיל תא-כבד T מסייעים פתוגניים לפרופיל תא-כבד T רגולטוריים. כאשר מסתכלים על סמנים עבור תאים מסוגים שונים והשוואת ביטוי אחוזים בין חיות שטופלו ומטופלים כראוי ולכן הוא גם שיקול חשוב. רעיון המתעוררים במחקר MS עולה כי תאי B יש תפקיד חשוב demyelination אוטואימוניות. זה מבוסס על מחקרים מראים כי תאי B נחוצים מחדש של תאי T 20. רעיון זה נתמך על ידי ההצלחה של טיפולים כגון rituximab, נוגדן כנגד לשעבר CD20נלחץ על פני השטח של תאי B 21,22. כפי שהוכח על ידי ההצלחה של ocrelizumab נוגדן חד-שבטי בניסויים קליניים, תרופות המכוונות אפיטופים שונים של CD20 עשוי לשפר את היעילות של תרופות B במיקוד תא 23.
מגבלה אחת של הטכניקות שהוצגו כאן הוא שזה אפשרי עבור תאי מערכת החיסון להיכנס CNS אבל להיות מסוגל לנסוע parenchyma. אימונוהיסטוכימיה יכול לשמש כדי לזהות איזוק perivascular של תאים חיסוניים ולהעריך המרחק ב parenchyma בין חיות שטופלו ומטופלים כראוי. הגבלת פוטנציאל נוספת כרוכה את ההשפעות של Microbiome על בפתוגנזה EAE. חיידקים במעי commensal יכולים להשפיע מחלה בפתוגנזה בכבדות 24; ולכן, עכברים שוכנו מושבות שונות ואף בכלובים שונים יכולים להיות הבדלים עצומים חומרת המחלה. בהתאם לכך, הוא תמיד עדיף במידת האפשר להשתמש שולטת להמלטה שהועלו באותו כלוב עבורניסויים הכוללים EAE. ההערה אחרונה היא שאם רצוי ניסיוני לחסל את ההשפעות של שינויי שגשוג תאים חיסוניים בפריפריה, יתכן שניתן יהיה לעשות זאת באמצעות אינדוקצית העברה פסיבית ולא האינדוקציה הפעילה המתואר בפרוטוקול זה.
אישור נוסף עבור neuroprotection ניתן להשיג באמצעות מערכת תרבות שיתוף 11 לבחון מנגנונים ספציפיים של מוות של תאים או באמצעות עכברים בנוקאאוט מותנים המאפשר למחיקה של חלבונים באופן סלקטיבי על סוג תא. יתר על כן, להאריך את החיפושים של סוכנים תרופתיים כי הם נוירו, סמנים של חיתוך רוחב אקסונלית ומוות עצבי צריכים להיכלל. תחום נוסף בעל חשיבות הוא מיאלין מחדש. אקסונים הפצועים אינם מסוגלים remyelinate הלוואות תמיכה נוספת כי טיפולים נוירו צריכים להיות חלק חשוב של טיפולי מיאלין מחדש. בנוסף, אקסונים unmyelinated פגיעים יותר פגיעה מאשר myelinaאקסונים טד. הדבר מצביע על כך כאשר האקסון הופך התערבויות טיפוליות demyelinated מקדם מיאלין מחדש בזמן ימנע פגיעה אקסונלית. כדי לבחון דרכים אלה, במודלים vivo אחרים עבור demyelination ויצירת מיאלין ניתן להשתמש (כלומר, cuprizone ו lysolecithin). השיטה המתוארת במסמך זה התמקד בהערכת neuroprotection ידי לכימות אובדן המיאלין. לצורך ההערכה של מיאלין מחדש במספר ובתאים כמו גם היכולת שלהם להתרבות ובוגר גם יהיה חשוב לחקור. עם האזכור של מודלים חלופיים אלה, יש לקחת בחשבון גם דגמים שונים של דלקת קרום המוח כי מתווכות באופן ויראלי. ישנם שני דגמים ויראלי RNA היטב מאופיין המייצרים אובדן המיאלין: אחד הוא encephalomyelitis בעכברים של Theiler, וירוס Picornaviridae הלא אפוף, והשני הוא נגיף הפטיטיס העכבר, חבר של משפחת וירוס Coronaviridae 25,26.
EAE הוא כלי רב ערך עבור studies של כמה מניפולציות או טיפולים להשפיע על המערכת החיסונית ועל מערכת העצבים המרכזית in vivo. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לעזור לקבוע היכן שהטיפולים משפיעים על תהליך המחלה, בין אם זה יהיה בפריפריה, על המחסום שבין הדם למוח, או במערכת העצבים המרכזית. אין טיפולים שוטפים עבור MS לרפא את המחלה וחולים חווים לעתים קרובות ירידה לאורך זמן. באופן דומה, מחלות אחרות הקשורות חדירת תא החיסון לתוך מערכת העצבים המרכזית ואת ההשפלה של המיאלין, כולל encephalomyelitis המופץ חריפה, דלקת רוחבית של חוט, ואת neuromyelitis אופטיקה, טיפולים חוסר המגנות על מערכת העצבים המרכזית כפי שהוא ישירות מותקף על ידי הסתננות תאי חיסון. אם ניקח בחשבון את העיתוי של טיפול באמצעות ניתוח תזרים cytometric של הטחול ואת חוט השדרה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה של מערכת העצבים המרכזית על מנת להעריך דלקת ונזק יאפשר לקביעות המכניסטי במעשה להתבצע לגבי טיפולים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו מומנה על ידי NINDS P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, קרן המחקר הבינלאומית Civitan, הקרן רוחבית בעמוד השדרה מייק ל Jezdimir, האוניברסיטה של קרן שירותי אלבמה בריאות – קרן תרומות כללית, הלאומי קרן המדע 1355183, ו T32 AI007051 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכונים הלאומיים לבריאות.
22 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9719245 | |
22 x 30 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9531194 | |
2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
2-Methylbutane | Fisher Scientific | O3551-4 | |
30 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | 18-30 | |
ACK Lysing Buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
anti-CD4 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552775 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Foxp3-FITC | eBioscience | 11-5773-82 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-GFAP (Cocktail) | Biolegend | 835301 | 1-3 mg/mL stock concentration |
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug) | Wako | 019-19741 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-IFN-γ APC | eBioscience | 17-7311-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-7177-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Ki-67 PE | eBioscience | 12-5698-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-MBP (D-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13912 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ FITC | eBioscience | 11-5961-85 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ PE | eBioscience | 12-5961-83 | 0.2 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG | Vector Labs | BA-1000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG | Vector Labs | BA-2000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% | Fisher Scientific | AC42356-5000 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% | Fisher Scientific | AC446085000 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Foxp3 transcription factor staining reagents |
Golgi Plug | BD Biosciences | 555029 | protein transport inhibitor |
Immedge Hydrophobic Barrier Pen | Fisher Scientific | NC9545623 | |
Ionomycin | EMD Millipore | 407952-5mg | |
L-Glutamine, 100X | Corning | 25-005-Cl | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | |
Near IR Live/Dead Staining Kit | Life Technologies | L10119 | viability dye |
Normal goat serum | Vector Labs | S-1000 | |
Normal horse serum | Vector Labs | S-2000 | |
Paraformaldehyde, 96% | Fisher Scientific | AC416785000 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | density gradient |
Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | resinous mounting medium |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1mg | |
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody | BioLegend | 808401 | |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | nonionic detergent |
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) | Fisher Scientific | NC9206402 | avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase |
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) | Fisher Scientific | NC9276270 | DAB solution |