This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.
A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.
Multiple sclerose (MS) wordt gekenmerkt door inflammatoire lesies overwegend witte stof hersengebieden begin van de ziekte. Na langdurige progressie is grijze stof atrofie gedetecteerd door MRI en markeert de neurodegeneratieve fase van de ziekte. Reactieve gliosis, demyelinisatie en axonale schade in de witte stof worden toegeschreven aan CNS-infiltrerende immuuncellen. Geen van de behandelingen momenteel in MS keren of direct neurodegeneratie te voorkomen in het CZS – maar verminderen ze ontstekingen dempt T-celactivering en / of infiltratie in het CNS. Omdat er geen genezing voor MS en patiënten met behulp van de huidige behandelingen blijven progressie van de ziekte ervaren, ontdekkingen van geneesmiddelen die demyelinisatie en neuronale verlies te voorkomen zijn van cruciaal belang. Echter een verschil tussen de effecten op immune cellen en die op het centrale zenuwstelsel kan moeilijk experimenteel zijn, als resultaat – dat wil zeggen, minder schade aan het CZS – ziet de same ongeacht de mechanismen waardoor het zich voordoet. Daarom moet het mogelijk CZS bescherming worden samen met beoordeling van CNS-infiltrerende immuuncellen en proliferatie van immuuncellen in de periferie te bepalen hoe farmacologische middelen beïnvloeden ziektemechanisme.
Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel van autoimmune ontstekingsziekten die direct verantwoordelijk voor de ontdekking van geneesmiddelen die momenteel voor de behandeling van MS 1-4 was. Muizen worden vaak gebruikt voor EAE, met C57BL / 6-muizen een populaire soort, afkomstig van de beschikbaarheid van genetische varianten. C57BL / 6-muizen geïnduceerd met EAE vertonen chronische progressie van de ziekte optreden rond dag 10 na inductie. Infiltratie van het ruggenmerg parenchym en cerebellum zijn kenmerkend voor de histopathologie van deze dieren, met afwezigheid van infiltratie in de corticale parenchym 5. Bovendien, corticale letsels en demyelinisatie in Bregen zijn kenmerken van de ziekte 6-9, die relatief afwezig in C57BL / 6 muizen. Daarom kan het de voorkeur indien mogelijk SJL muizen, die recidieve ziekten en afwijkingen in zowel de hersenen en het ruggenmerg die vergelijkbaar zijn met die in MS 10 weergegeven hebben gebruikt.
De behandeling kan niet worden aangemerkt als neurobeschermende als immuuncellen de CNS nooit bereiken. Daarom dit protocol maakt gebruik van flowcytometrische analyse van hersenen, ruggenmerg en de milt van muizen EAE behandelingseffecten op immuuncellen infiltratie in het CNS en de proliferatie van immune cellen in de periferie te bepalen zoals eerder aangetoond 11. Immunohistochemische analyses van CZS-weefsel te bepalen omvang en aard van neuroprotectie wordt ook beschreven. Een combinatie van deze methoden maakt te bepalen of immune cellen geactiveerd en verspreidden zich in de periferie of immuuncellen ging de CNS en of het CNS was protected van ontsteking of beschadiging. Als neuroprotectieve effecten worden verdacht ondanks effecten op het immuunsysteem, kunnen onderzoekers veranderen behandeling starttijden na immune cel infiltratie in het CNS is opgetreden.
Hier presenteren we een protocol met twee verschillende modellen van actieve EAE, een T-cel gemedieerde diermodel van MS en flowcytometrie analyse gecombineerd met immunohistochemie op verschillende tijdstippen tijdens de ziekte op de werkzaamheid van experimentele therapieën bepalen verschillende aspecten van MS pathogenese. Deze methode zal onderzoekers helpen bij het differentiëren tussen de effecten op het immuunsysteem proliferatie en infiltratie versus CNS bescherming cel, waardoor het makkelijker wordt om een beperking van hoe drugs handelen pathogenese van de ziekte.
Patiënten met MS blijven ziekte recidieven ervaren tijdens het nemen van drugs dat T cel activatie en / of infiltratie te verzwakken in het centraal zenuwstelsel, rechtvaardigt de ontwikkeling van de behandeling opties die het centrale zenuwstelsel rechtstreeks te beschermen. EAE is klassiek gebruikt om de symptomen van MS model en kan een krachtig hulpmiddel zijn bij het bestuderen van de aard van de interacties tussen het immuunsysteem en het centrale zenuwstelsel in vivo. Gebruik timing van de behandeling overwegingen in EAE, bijvoorbeeld voor of na het begin van ziekte, in samenhang met de behandeling immuuncel infiltratie in het CZS en proliferatie en activering in de periferie is het mogelijk de effecten van behandelingen in te gaan op zowel het immuunsysteem het CNS.
Terwijl EAE in de C57BL / 6 muis op grotere schaal toegepast, kunnen EAE in SJL muizen representatiever voor de meeste gevallen van MS, omdat deze muizen een relapsing remitting fenotype en infiltratie van immuuncellen in het parenchymvan de hersenen 10. SJL muizen duidelijk herstel tijdens remissie en maakt het mogelijk om de behandeling te beginnen nadat de ziekte is gepresenteerd, maar in tijden van verminderde ontsteking. Het is belangrijk om te overwegen dat SJL muizen niet altijd terugvallen en afdragen synchroon, wat resulteert in potentieel grote variabiliteit wanneer de resultaten worden samengevoegd. Daarom kunnen sommige onderzoekers kiezen om representatieve resultaten voor de klinische scores te tonen van het ene dier tijdens het gebruik van muizen voor FACS-analyse en histologie bij geïndividualiseerde punten in de progressie van de ziekte.
Aangezien bij manipulaties worden gegeven aan EAE muizen kunnen helpen bij het bepalen hoe een behandeling beïnvloedt het immuunsysteem of CNS. Er zijn vele opties voor als behandeling begint, elk met zijn eigen connotatie of immuuncellen het CZS heeft ingevoerd en hoe ze kunnen krijgen met het CNS. Behandeling vóór aanvang van de symptomen impliceert dat immuuncellen nog niet heeft ingevoerd of veroorzaakt schade aan het centrale zenuwstelsel.Behandeling na aanvang van de symptomen impliceert dat afweercellen de CNS zijn binnengekomen en wat schade hebben veroorzaakt. SJL-muizen gebruikt, kan de behandeling ook beginnen in een terugval, waarbij immuuncellen actief infiltreren en die ontsteking of tijdens remissie, waarbij immuuncellen minder vaak in het CZS kunnen met minder ontstekingen. Initiële hypotheses over hoe behandelingen beïnvloeden het CNS en het immuunsysteem kan worden gemaakt bij het overwegen wanneer immuuncellen in het ziekteproces tijdens de behandeling.
Er zijn een aantal manieren waarop behandelingen kunnen beïnvloeden immuuncellen en de CNS, elk met het eindresultaat van het verminderen ernst van EAE symptomen. Daarom is het noodzakelijk om flowcytometrische analyse en immunohistochemie om te kijken hoe immuuncellen worden beïnvloed in de periferie en CZS of immuuncellen het CZS heeft ingevoerd, en hoe het CZS reageert op behandeling. Terwijl flowcytometrische analyse van het ruggenmerg kan bepalen hoeveel cellen have ging de CNS op een gegeven moment, kan men vaststellen dat dit effect door verminderde immuuncel handel tenzij proliferatie van immuuncellen wordt niet beïnvloed in de milt. Daarom is het noodzakelijk om zowel perifere als CNS weefsel te analyseren en te bepalen welke resultaten mechanistisch bedoel wanneer beide weefsels worden vergeleken. Het is ook mogelijk dat immuuncel activiteitsprofielen worden gewijzigd door behandeling, bijvoorbeeld met een schakelaar in een pathogene helper T-cel-zwaar profiel een regulatoire T cel zware profiel. Kijkend naar merkers voor verschillende celtypes en vergelijken procent expressie tussen behandelde en onbehandelde dieren is dan ook een belangrijke overweging. Een nieuwe concept in het MS onderzoek suggereert dat B-cellen een belangrijke rol in auto-immune demyelinisatie spelen. Dit is gebaseerd op studies blijkt dat B-cellen nodig zijn voor de reactivering van T-cellen 20. Dit concept wordt ondersteund door het succes van behandelingen zoals rituximab, een antilichaam tegen CD20 exgedrukt op het oppervlak van B-cellen 21,22. Zoals aangetoond door het succes van het monoklonale antilichaam ocrelizumab in klinische studies, kunnen medicijnen die verschillende epitopen van CD20 de werkzaamheid van B-cel gerichte therapieën 23 verbeteren.
Een beperking van de hier gepresenteerde technieken is dat het mogelijk is immuuncellen het CZS voeren maar niet in staat om in de parenchym. Immunohistochemie kan worden gebruikt om perivasculaire cuffing van immuuncellen detecteren en beoordelen afstand in het parenchym tussen behandelde en onbehandelde dieren. Een andere mogelijke beperking betreft de werking van de microbiome op EAE pathogenese. Commensal darmflora kan een enorme invloed op de ziekte pathogenese 24; derhalve muizen ondergebracht in verschillende kolonies en zelfs in verschillende kooien kunnen grote verschillen in ernst van de ziekte hebben. Dienovereenkomstig is het altijd beter om waar mogelijk nestgenoot controles opgegroeid in dezelfde kooi voor gebruikexperimenten met EAE. Een laatste opmerking is dat als het experimenteel wenselijk het immuunsysteem van cel proliferatieve veranderingen in de periferie te elimineren, kan het mogelijk zijn om dit te doen met passieve overdracht inductie in plaats van de actieve inductie beschreven in dit protocol.
Verdere bevestiging voor neuroprotectie kunnen worden met behulp van een co-kweeksysteem 11 specifieke mechanismen van celdood of door het gebruik van conditionele knockout muizen die zorgt voor verwijdering van eiwitten op selectieve wijze op een celtype testen. Bovendien, om de exploratie van farmacologische middelen die neuroprotectieve zijn uit te breiden, moet markers van axonale doorsnijding en neuronale dood worden opgenomen. Een ander punt van belang is remyelinisatie. Gewonde axonen zijn niet remyelinate lenen verdere ondersteuning dat neuroprotectieve therapieën een belangrijk onderdeel van remyelinisatie therapie moet worden. Bovendien, niet-gemyeliniseerde axonen zijn gevoeliger voor schade dan myelinated axonen. Dit suggereert dat wanneer een axon wordt gedemyeliniseerde therapeutische interventies die tijdig remyelination zal axonen letsel te voorkomen promoten. Om deze mogelijkheden te ontdekken, kunnen andere in vivo modellen voor demyelinisatie en remyelinisatie worden gebruikt (bijv cuprizone en lysolecithine). De hierin beschreven werkwijze gericht op het beoordelen van neuroprotectie door het kwantificeren van myeline verlies. Voor de evaluatie van remyelinisatie het aantal voorlopercellen en hun vermogen om te prolifereren en rijpen ook belangrijk onderzoeken. Met het noemen van deze alternatieve modellen, moet men ook rekening houden met verschillende modellen van hersenontsteking die viraal worden bemiddeld. Er zijn twee goed gekarakteriseerde virale RNA modellen myeline verlies produceren: men Theiler's murine encephalomyelitis, een niet-omhulde Picornaviridae virus, en de andere muis hepatitis virus, lid van de familie Coronaviridae virus 25,26.
EAE is een waardevol instrument voor studies hoe manipulaties of behandelingen invloed op het immuunsysteem en het CZS in vivo. Het protocol beschreven kunnen helpen bepalen waar behandelingen beïnvloeden het ziekteproces, of het nu in de periferie van de bloed-hersenbarrière of in het CZS. Geen huidige behandelingen voor MS te genezen van de ziekte en de patiënten vaak last van verval in de tijd. Evenzo kunnen andere ziekten waarbij immune cel infiltratie in het CNS en de afbraak van myeline, waaronder acute gedissemineerde encefalomyelitis, transversale myelitis en neuromyelitis optica, gebrek behandelingen die het CZS beschermen zij rechtstreeks aangevallen door infiltrerende immuuncellen. Gezien de timing van de behandeling en het gebruik van flowcytometrische analyse van de milt en het ruggenmerg samen met immunohistochemie van het centraal zenuwstelsel aan ontsteking en beschadiging evalueren zal zorgen voor mechanische vaststellingen worden gemaakt voor behandelingen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door NINDS P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, De Civitan International Research Foundation, The Mike L. Jezdimir Transversale Myelitis Foundation, de Universiteit van Alabama Health Services Foundation – General Endowment Fund, The National Science Foundation 1355183, en T32 AI007051 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Besmettelijke Ziekten, National Institutes of Health.
22 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9719245 | |
22 x 30 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9531194 | |
2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
2-Methylbutane | Fisher Scientific | O3551-4 | |
30 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | 18-30 | |
ACK Lysing Buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
anti-CD4 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552775 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Foxp3-FITC | eBioscience | 11-5773-82 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-GFAP (Cocktail) | Biolegend | 835301 | 1-3 mg/mL stock concentration |
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug) | Wako | 019-19741 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-IFN-γ APC | eBioscience | 17-7311-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-7177-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Ki-67 PE | eBioscience | 12-5698-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-MBP (D-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13912 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ FITC | eBioscience | 11-5961-85 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ PE | eBioscience | 12-5961-83 | 0.2 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG | Vector Labs | BA-1000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG | Vector Labs | BA-2000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% | Fisher Scientific | AC42356-5000 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% | Fisher Scientific | AC446085000 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Foxp3 transcription factor staining reagents |
Golgi Plug | BD Biosciences | 555029 | protein transport inhibitor |
Immedge Hydrophobic Barrier Pen | Fisher Scientific | NC9545623 | |
Ionomycin | EMD Millipore | 407952-5mg | |
L-Glutamine, 100X | Corning | 25-005-Cl | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | |
Near IR Live/Dead Staining Kit | Life Technologies | L10119 | viability dye |
Normal goat serum | Vector Labs | S-1000 | |
Normal horse serum | Vector Labs | S-2000 | |
Paraformaldehyde, 96% | Fisher Scientific | AC416785000 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | density gradient |
Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | resinous mounting medium |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1mg | |
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody | BioLegend | 808401 | |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | nonionic detergent |
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) | Fisher Scientific | NC9206402 | avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase |
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) | Fisher Scientific | NC9276270 | DAB solution |