ハイスループット遺伝子タギングで<em>トリパノソーマ</em
Summary
Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Abstract
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Introduction
トリパノソーマは 、ウシにおける人間のアフリカtrypanosomasisとナガナ病を引き起こす寄生原虫である。T.トリパノソーマは 、高品質のゲノム、多数のプロテオミクスおよびトランスクリプトームデータセットとよく発達した分子ツール1-3の組み合わせにタンパク質機能の解析のための理想的な生物です。プロテオミクスおよびシーケンシングの進歩は、潜在的に興味深い遺伝子4-6ハイライト表示し、大規模なデータセットをもたらしています。しかし、多くの遺伝子は、既存のデータベースに、それらに関連する最小限の情報を持っています。タンパク質の機能的特徴付けを支援するためのハイスループット法が必要とされています。
タグ付けされたタンパク質の発現は、タンパク質の機能への洞察の多様性を与えることができます。例えば、蛍光タンパク質またはエピトープでタグ付けされたタンパク質は、protのについての情報を提供する、蛍光顕微鏡によってローカライズすることができますEINはその生物学的効果を発揮する可能性があります。また、TAP 7でタグ付けされたタンパク質は、HaloTag 8またはHisタグは、生化学的ア ッセイおよびその相互作用パートナーの同定のために精製することができます。
我々は最近、T.ための堅牢なタグ付けの方法論を開発しましたトリパノソーマ 9。これは、トランスフェクションのためのDNAを生成するために、長いプライマーPCRを使用し、並列中のタンパク質の数十のタギング許可 – 既存のプロトコルへの主要な改善を。我々は今一桁procyclic形で、このプロトコルの拡張性を改善しています。ここでは、回復と選択が24ウェルプレート内で発生して、96ウェルプレートに我々の我々は、PCRを行う方法およびトランスフェクションを示します。タンパク質の数百人が今並列にタグを付けることができますように、この方法は、全体トリパノソーマゲノムをタグ付けするための費用対効果や実現可能な方法を提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
最後の5年から10年におけるプロテオミクスとトランスクリプトミクスの方法の感度の劇的な改善は、遺伝子およびそれらの製品の何千もの貴重なデータを提供してきました。しかし、これらのタンパク質の機能に対応するためのツールが追いついていません。
タンパク質のタグ付けは、その機能を決定するために多くの実験を容易にします。例えば、タンパク質は、局在化および共局在研究を容易にするために、異なる色の様々な蛍光タンパク質に融合することができます。このようなAPEX2やminiSOG 11,12などの電子顕微鏡用に開発されたタグ、タグタンパク質の超微局在を可能にします。このようなTAPタグ、およびProtC-TEV-PROTA（PTP）などの生化学用のタグは、7,13は、結合パートナーの同定のためまたはインビトロ生化学アッセイでタンパク質と結合した複合体の精製を可能にするタグ。
protocの成功に重要である特定の手順、PCRマスターミックス1へのDMSOの取り込みマスターミックス2、マスターミックス2の商業ポリメラーゼの使用とcytomixエレクトロポレーションバッファの変更を加える前に、PCRマスターミックス1の凍結：オールがあります。我々の経験では、陽性ウェルの類似の比率を達成するために、N末端タグのトランスフェクションのためのように、C末端タグのトランスフェクションのための細胞の二重の数を使用する必要があります。記載されているようにそのため、すべてのステップを実行する必要があります。
この技術は、昆虫procyclicフォームトリパノソーマをトランスフェクションする際に成功する唯一の可能性があります。血流フォームは低いトランスフェクション効率14を持って、しかもそれらが原因で、選択薬とは無関係の密度依存毒性に選択中に死亡する可能性があります。したがって、我々の以前のプロトコルは、血流フォームトリパノソーマ9のタグ付けのための現在の最高の技術を表しています。また、トランス、その可能性がありますフェクション効率は、特定のトリパノソーマの分離株に依存して変化するであろう。他の株は、追加の最適化を必要とするかもしれない – このプロトコルは927 SMOX procyclicフォームを使用して最適化しました。成功の確率を高めることができる対策は、次のとおり、PCRアンプリコンの量を増加させるトランスフェクションに含まれるセルの数を増加させます。
我々は、タンパク質の数百を並列にタグを付けることができます方法を提示します。これは、既存の大規模なデータセットを補完し、コミュニティに貴重な情報を提供し、局在との相互作用に大規模な研究を促進します。プライマーテンプレートは、リクエストに応じて利用可能であり、プラスミドテンプレートのリストは、から入手できます。http://www.sdeanresearch.com/
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Materials
| Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
| DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
| dNTP | any reputable | ||
| Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
| BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
| HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
| MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
| Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
| Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
| Phleomycin | Melford | P0187 | |
| 225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
| 24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
| Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
| 96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |
References
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