Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei is een protozoa parasiet die humane Afrikaanse trypanosomasis en Nagana bij runderen veroorzaakt. T. brucei ideaal organisme voor de analyse van eiwitfunctie door de combinatie van een hoge kwaliteit genoom talrijke proteomics en transcriptomics datasets en goed ontwikkelde moleculaire technieken 1-3. Vooruitgang in proteomics en sequencing hebben geresulteerd in grote datasets die potentieel interessante genen 4-6 te benadrukken; echter veel genen minimale informatie die bij hen in de bestaande gegevensbanken. Er is derhalve behoefte aan een high-throughput werkwijze voor het eiwit functionele karakterisatie steun.
Expressie van een gelabeld eiwit kan een veelheid aan inzichten geven in de functie van een eiwit. Zo kan een eiwit gelabeld met een fluorescerend eiwit of epitoop gelokaliseerd door fluorescentiemicroscopie met informatie over waar de prot geeftein zou kunnen uitoefenen zijn biologische effect. Als alternatief, een eiwit gelabeld met een TAP 7, HaloTag 8 of His tag kan worden gezuiverd voor biochemische analyses en identificatie van de interactie tussen partners.
We hebben onlangs ontwikkelde een robuuste tagging methode voor T. brucei 9. Dit was lange PCR primer met het DNA voor transfectie genereren en kon de tagging tientallen eiwitten in parallel – een significante verbetering van bestaande protocollen. We hebben nu een verbetering van de schaalbaarheid van dit protocol in procyclische vormen door een orde van grootte. Hier presenteren we onze werkwijze waar we PCR en transfectie uitgevoerd in 96-well platen, met de terugwinning en selectie zich in 24-well platen. Honderden proteïnen nu kan worden gelabeld parallel deze methode een kosteneffectieve en werkbare methode voor het coderen van het gehele genoom trypanosoom.
Drastische verbeteringen in de gevoeligheid van proteomics en transcriptomics methoden in de afgelopen 5-10 jaar heeft waardevolle gegevens over duizenden genen en hun producten. De instrumenten aan te pakken de functie van deze eiwitten hebben geen gelijke tred gehouden.
Tagging een eiwit vergemakkelijkt talrijke experimenten om de functie te bepalen. Zo kan een eiwit worden gefuseerd aan een fluorescerend eiwit in een verscheidenheid van verschillende kleuren localisatie en co-localisatie studies te vergemakkelijken. Markeringen ontwikkeld voor elektronenmicroscopie, zoals APEX2 of miniSOG 11,12 toestaan ultrastructurele lokalisatie van het gecodeerde eiwit. Tags for biochemie, zoals TAP tag en ProtC-TEV-ProtA (PTP) tag 7,13 zodat zuivering van complexen geassocieerd met het eiwit voor het identificeren van bindingspartners of in vitro biochemische assays.
De specifieke stappen die cruciaal zijn voor het succes van de protoc zijnol zijn: de opname van DMSO in de PCR Master Mix 1, het bevriezen van de PCR Master Mix 1 voorafgaand aan de toevoeging van de Master Mix 2, het gebruik van de commerciële polymerase in Master Mix 2 en de wijziging van de cytomix elektroporatie buffer. In onze ervaring, is het noodzakelijk om het dubbele van het aantal cellen te gebruiken voor C-terminale tagging transfecties als voor N-terminale tagging transfecties met het oog op een vergelijkbaar percentage van positieve putjes te bereiken. Daarom moeten alle stappen worden uitgevoerd zoals beschreven.
Deze techniek is alleen kans van slagen als het transfecteren van het insect procyclische vorm trypanosoom. Bloedstroomvormen hebben een lagere transfectie-efficiëntie 14, bovendien zijn ze waarschijnlijk tijdens de selectie om te sterven als gevolg van de dichtheid-afhankelijke toxiciteit die geen verband houdt met de selectieve drug. Daarom is onze vorige protocol vertegenwoordigt de huidige beste technologie voor het etiketteren van bloed vorm trypanosomen 9. Het is ook waarschijnlijk dat de transfection efficiency zal afhangen van de specifieke trypanosoom isolaat variëren. Dit protocol werd geoptimaliseerd met behulp van 927 SMOX procyclische vormen – andere stammen kunnen extra optimalisatie nodig. Maatregelen die de kans op succes kunnen verhogen zijn: het verhogen van de hoeveelheid PCR amplicon, waardoor het aantal cellen in de transfectie.
We presenteren een methode waarbij honderden eiwitten kunnen worden gelabeld parallel. Dit zal grootschalige studies te vergemakkelijken op lokalisatie en interactie, als aanvulling op bestaande grote datasets en het verstrekken van waardevolle informatie aan de gemeenschap. Primer templates zijn beschikbaar op aanvraag en een lijst van plasmiden templates beschikbaar is beschikbaar op: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |