Summary

Быстрое Молекулярная Обнаружение и дифференциация вирусов гриппа А и В

Published: January 30, 2017
doi:

Summary

Мы описываем быстрый, молекулярный основе гриппа A и B анализа. Гриппа тест определяет каждую мишень в течение 15 мин с использованием изотермического амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. И В анализе гриппа А удобно и требует минимальных практического времени для выполнения.

Abstract

Грипп является респираторное заболевание, вызываемое вирусами гриппа А и В в организме человека и вызывает значительное количество заболеваемости и смертности ежегодно. Гриппа A и B для анализа был первый тест молекулярного быстрого гриппа ОРСУ-отказ от имеющихся. Испытание гриппа A и B работает с использованием изотермического амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. При этом производительность гриппа A и B для анализа на замороженное, архивируются носоглотки тампон (NPS) образцов, хранящийся в вирусной транспортной среде (VTM) сравнивали с анализом респираторного панели.

Производительность А и В анализе гриппа оценивали путем сравнения результатов с эталонной панели методом респираторной. Чувствительность к общей вируса гриппа А составила 67,5% (95% ДИ (ДИ), 56.6-78.5) и специфичность 86,9% (CI, 71.0-100). Для тестирования вируса гриппа B, чувствительность и специфичность составили 90,2% (ДИ 68.5-100) И 98,8% (ДИ 68.5-100), соответственно.

Эта система имеет преимущество значительно более короткого времени испытания, чем любой другой доступный в настоящее время молекулярного анализа и простой, пипеткой свободной процедуры работает на полностью интегрированной, закрытая, система малой площади. В целом, гриппа A и B оценивали анализ в данном исследовании, имеет потенциал, чтобы служить в качестве диагностического теста быстрого гриппа точки оказания медицинской помощи.

Introduction

Вирус гриппа инфекции приводят к значительному количеству заболеваемости и смертности каждый год 1, 2, 3. Несложный гриппа характеризуется конституционными и респираторные симптомы , такие как лихорадка, миалгии, головная боль и непродуктивный кашель 4, 5. Люди старшего возраста, детей младшего возраста, пациентов с ослабленным иммунитетом, а также у пациентов с сопутствующими заболеваниями , лежащих в основе находятся на более высоком риске для серьезных осложнений , таких как пневмония, миокардит, заболевания центральной нервной системы, или смерти 6, 7.

Инфекция гриппа является уникальным от других респираторных вирусов в том , что быстрое введения противовирусной терапии в течение 48 часов после появления симптомов может уменьшить тяжесть заболевания и длину 8. Быстрая идентификация гриппа также былапоказано , чтобы уменьшить использование ненужных антибиотиков 9, 10. Кроме того, госпитализированных пациентов с инфекцией гриппа должны быть размещены в изолированных помещениях с соответствующими мер инфекционного контроля. Тем не менее, респираторные заболевания, вызванные вирусами гриппа, не может быть трудно клинически отличить от гриппа. По этой причине, быстрого и точного диагностического тестирования на грипп является очень важным для клинического лечения пациента.

Некоторые анализы доступны для обнаружения и идентификации вирусов гриппа. Экспресс – тесты для выявления антигенов гриппа (RIDTs) широко используются в клинической практике в качестве точки оказания медицинской помощи тестов , потому что они просты в использовании и обеспечивают результаты в течение от 15 до 30 мин 11, 12; Тем не менее, их чувствительность широко (10-80%) в зависимости от производителя и населения испытывается различаются, и типа гриппа и subtyре 13, 14, 15. Прямые анализы флуоресценции (ДКА) обеспечивают превосходные чувствительность над RIDTs, но время обработки больше (~ 3 ч) и должны быть завершены квалифицированными технологами 16, 17. Вирусная культура была золотым стандартом для диагностики гриппа и улучшилась чувствительность в отношении обоих RIDTs и ДКА 18. Тем не менее, грипп вирусная культура может занять от 2-14 г до завершения, уменьшая его полезность в помощи лечения пациента 19. И, наконец, тесты амплификации нуклеиновых кислот (NAAT) заменили методы культуры в качестве нового золотого стандарта в диагностике гриппа. NAAT считаются имеющими наибольшую чувствительность для обнаружения гриппа в течение нескольких часов. Однако NAAT самые дорогие анализы и требуют специализированного оборудования и технологов для выполнения 5 <sвверх>, 20, 21, 22, 23, 24, 25.

Анализ гриппа А и В, описанный здесь первый ОРСУ-отказ от молекулярного экспресс-тест гриппа, который легко доступен. Этот анализ работает с использованием реакция перекреста Эндонуклеаза Amplification (Near), который использует изотермический амплификации с гриппом специфических праймеров с последующим обнаружения цели с зондами молекулярных радиомаяка. Этот анализ отличает гриппа A от B, требуется 2 минуты, чтобы установить и обработать один образец, и требует в общей сложности 15 минут, чтобы закончить.

Здесь мы представляем протокол для анализа гриппа A & B. Кроме того, мы предлагаем образец набора данных сравнения характеристик вируса гриппа A и B анализа на архивизированных носоглотки тампон (NPS) экземпляры хранятся в вирусной транспортной среде (VTМ) к другому респираторного анализа возбудитель панели.

Protocol

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Использование левой более клинических образцов одобрен и соответствует рекомендациям Совета по Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review. 1. Перед запуском Пробирной ПРИМЕЧАНИЕ: Грипп A и B анализ одобрен для носоглотки образцов мазков и носоглотки мазков, хранящихся в в…

Representative Results

В этом исследовании, заархивированные образцы NPS собирали из стационарных больных, представляющих с гриппоподобными симптомами в Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) во время вспышки гриппа в период с 15 декабря 2012 года и 1 марта 2013 г. Образцы NPS были представлены в 3 мл СУДС и прохо…

Discussion

Вирусы гриппа значительные мировые причины заболеваемости и смертности. Быстрый и точный диагноз гриппа является одним из основных ключей к управлению во время вспышки гриппа респираторного сезона. Другие тесты антиген на основе являются быстрым и легким для выполнения; Тем не менее,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Clinical Microbiology Service staff of the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center for help in collecting clinical specimens. This study was supported in part by a research agreement between MSKCC and Alere Scarborough (SK2013-0262).

Materials

Alere i Instrument Alere NAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Test Kit Alere 425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode Scanner Alere EQ001001
Alere Universal Printer Alere 55115 (Global), alereiprinter (US)
200 µL precision pipette
200 µL disposable pipette tips
Viral transport medium Remel M4-RT

References

  1. . . Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices–United States, 2013-2014. , 1-43 (2013).
  2. Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
  3. . Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza — United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
  4. Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
  5. Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, 312-325 (2011).
  6. Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
  7. Molinari, N. -. A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
  8. Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
  9. Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
  10. Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
  11. Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
  12. van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
  13. Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
  14. Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza — recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
  15. Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children–diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
  16. Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
  17. Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
  18. Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
  19. Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244 (2010).
  20. Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
  21. Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
  22. Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
  23. Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
  24. Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
  25. Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
  26. Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
  27. Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
  28. Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).

Play Video

Cite This Article
Otto, C. C., Kaplan, S. E., Stiles, J., Mikhlina, A., Lee, C., Babady, N. E., Tang, Y. Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B. J. Vis. Exp. (119), e54312, doi:10.3791/54312 (2017).

View Video