El calcio de imágenes en<em> Drosophila</em> En la activación del huevo

Nota: Llevar a cabo todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. 1. Preparación para la disección Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con E. Gavis, la Universidad de Princeton y Weil et al. al. 18. Realice los pasos siguientes dos días antes de la proyección de imagen. Tomar un vial mosca que contiene aproximadamente 10 ml de alimento sólido y añadir una pequeña cantidad de levadura seca a una esquina, a menos de 1 g es suficiente. Nota: Para obtener información acerca de los viales de moscas o comida ver 'Mantenimiento de Drosophila' 19. Añadir 1 – 3 gotas de agua para hidratar la levadura. Dejar reposar el vial en un ángulo de 45 ° y permita 3 – 5 min para que la levadura para tomar el agua. Mientras que la levadura está absorbiendo el agua, seleccionar una botella de moscas que expresan UASt- GCaMP5 myr 20 impulsado por bañera-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que han surgido recientemente (a myristoyRELAClONADAS forma de la GCaMP5 fue elegido para proporcionar una alta relación señal a ruido a través de la inmovilización del GECI a la membrana en el huevo). Anestesiar las moscas en la botella con gas CO2. Asegúrese de mantener la botella invertida a fin de no perder las moscas en la comida húmeda. Inclinar las moscas anestesiadas sobre un bloque de CO 2 y tipo 10 – 15 hembras y 5 machos utilizando un pincel con un microscopio de disección. Nota: Es estándar para incluir los machos para proporcionar hembras saludables para la disección. Cuando el vial de la etapa 1.3 está listo, añadir las moscas seleccionados al vial. Tenga cuidado de mantener la horizontal vial hasta que las moscas se vuelven activos. Coloque el vial a 25 ° C durante aproximadamente 36 horas. Devolver los restantes moscas de la plataforma de CO 2 a la botella o descarte. 2. Disección de Drosophila ovarios Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con Weil et al. Alabama. <shasta> 18. Después de 36 horas, anestesiar las moscas del vial yeasted con CO2. Una vez que las moscas dentro del vial se anestesian propina en la almohadilla de CO 2 que ser resuelto con un cepillo de pintura con un microscopio de disección. Seleccione una hembra. Aislar los dos ovarios de la hembra. Para el protocolo completo y detallado ver Weil et al. al. 18. En resumen: Coloque una pequeña gota de aceite de hidrocarburo halogenado oxigenada (serie 95) en un 1,5 N, 22 x 40 mm cubreobjetos. Agarrar a la hembra con unas pinzas en la parte anterior del abdomen. Celebración de las mujeres bajo el microscopio de disección, utilice el segundo conjunto de pinzas para eliminar suavemente la parte posterior de la hembra. Limpie el tejido posterior de la segunda pinza. Estrújalo la cavidad abdomen con las segundas pinzas de la anterior a la posterior del abdomen. Los dos ovarios opacos deben atenerse a las pinzas cuando se encuentre fuera de la FEMALe. Tocar los ovarios en el aceite. Eliminar cualquier tejido de los fórceps frotando las pinzas. Repita estos pasos (2.4.1 – 2.4.7) para obtener tres cubreobjetos, cada uno de los ovarios que contienen de una mosca. 3. Aislamiento de óvulos maduros individual Bajo un microscopio de disección estándar con la ampliación fijado a 4X, en el primer cubreobjetos desde el paso 2.4, separar los dos ovarios rasgando el oviducto. Introducir un par de pinzas cerradas en el centro de un solo ovario, teniendo cuidado de no perforar ningún cámaras de huevos. Inserte una sonda de disección estándar en el centro del ovario al lado de las pinzas cerradas. arrastrar suavemente la sonda de disección a través del ovario hacia el polo posterior, donde se encuentran los óvulos maduros (etapa 14 cámaras de huevos). Repetir los pasos 3.1 – 3.4 2-5 veces dependiendo del tamaño del ovario y el número de huevos. Nota: La adición de CO 2 </sub> típicamente causa la deposición de un solo huevo que aparecerá más grande con apéndices dorsales planteadas que los huevos depositados previamente. Este huevo debe ser desechada para la imagen, puesto que ya se ha activado dentro de la hembra. Nota: los huevos maduros son propensos a separarse fácilmente del tejido conectivo del ovario. Si no hay óvulos maduros son visibles fuera del ovario, continuará burlas con la sonda de disección con suavidad. Una vez que los huevos maduros son visibles en el cubreobjetos fuera del ovario, maniobrar 3-5 en una línea en el centro del cubreobjetos. Nota: Para obtener los mejores resultados, ejecute la sonda suavemente a lo largo del lado de los huevos. Nota: Evite tirar de los apéndices dorsales ya que esto puede dañar el huevo. Nota: Dependiendo de la imagen futura creación, alinear los huevos de aproximadamente 200 micras aparte perpendicular a la cubreobjetos de área máxima de imagen. Una vez alineado, eliminar el resto del tejido ovárico arrastrándolo fuera de los huevos alineados utilizando el forceps. Eliminar el exceso de aceite frotando con la esquina de una toallita médica. Tenga cuidado de no tocar los huevos maduros con el médico toallita huevos maduros que están en contacto se perderán. Dibuje una cruz sobre el cubreobjetos con un marcador para simplificar la localización de la muestra bajo el microscopio. Ajuste el cubreobjetos en un lugar seguro y dejar las cámaras de huevos preparados en el cubreobjetos para descansar durante 5 – 10 minutos a. Esto permite que el huevo se asiente en el aceite. Las muestras se pueden utilizar hasta 1 hora después de la disección. Repetir los pasos 3.1 hasta 3.11 para el resto de los cubreobjetos con ovarios en ellos. 4. Preparación de la Imagen Llevar tampón de activación preparado 15 a temperatura ambiente. Nota: tampón de activación es un tampón hipotónico: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, NaCl 10 mM, KCl 50 mM, 5% de polietilenglicol 8000, 2 mM CaCl 2, se llevó a pH 6,4 con una 1: relación de 5 de NaOH: KOH.Para obtener más información, véase Mahowald de 1983 15. Alícuotas de tampón de activación se pueden almacenar a -20 ° C durante meses y a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas. transportar cuidadosamente preparados, cubreobjetos tampón de activación y pipetas de vidrio para la instalación de imágenes. Nota: Un campo amplio, confocal, disco giratorio o un microscopio de lámina de luz se pueden utilizar. Recomendamos el uso de un microscopio invertido. Nuestros resultados representativos se obtuvieron usando un microscopio confocal. Un objetivo adecuado para obtener imágenes de todo el óvulo maduro debe ser elegido (en este caso: 20X 0,7 NA). Montar la primera cubreobjetos preparado a la platina del microscopio. Tenga cuidado de no romper los cubreobjetos en el escenario. Cualitativamente seleccionar un campo de visión con una cámara de huevos maduros para la activación. Imagen No pinchado cámaras de huevos o aquellos con formación de vesículas en la membrana. Nota: Para ver los pasos 4.6 – 4.7, los comandos de software variarán dependiendo de microscopio y el fabricante. Conjunto de imágenes párrafometros para la excitación estándar GFP (488 nm) y emisión (500 – 580 nm). También configurar una vista de campo brillante con el fin de visualizar y orientar el óvulo maduro y aceite desplazado. Seleccione el más bajo de Z-plano en el que los óvulos maduros son visibles y establecer un Z-pila completa que se aplicará a 40 micras, con aproximadamente 2 micras por paso. Establecer los parámetros de lo que no hay retraso entre la adquisición de Z-pila. Establecer las series de tiempo para capturar durante aproximadamente 30 min. La activación ex vivo de imágenes 5. Huevo Iniciar la captura de imágenes. Espere a 1 – 2 completos Z-pilas para ser adquiridos. Esto muestra el óvulo maduro antes de la activación. Retirar aproximadamente 300 l de tampón de activación en una pipeta de vidrio. Colocación de la punta de la pipeta de vidrio que contiene tampón de activación en un ángulo de 45 ° por encima del cubreobjetos, mueva lentamente la pipeta en la trayectoria del haz hasta que está directamente encima del óvulo maduro está formando la imagen. La pipeta de vidrio debeser de 1 – 2 cm por encima del petróleo. Añadir 1 – 2 gotas de tampón de activación en menos de 5 segundos desde la pipeta de vidrio. Esto debería desplazar el aceite. Evitar la adición de exceso de tampón de activación o tocar el huevo con la pipeta de vidrio, ya que puede causar el desplazamiento del óvulo maduro. Tenga cuidado de no tocar el cubreobjetos con la pipeta ya que esto puede causar un cambio en el plano focal o burbujas de aire para formar en el aceite de inmersión entre el objetivo y el cubreobjetos. Mientras que la adición de tampón de activación durante la adquisición de imagen, compruebe el canal de campo brillante para asegurar que el aceite ha sido desplazado por el tampón de activación. Nota: Esto primera aparecer como una sombra debido a la pipeta romper la trayectoria del haz, pero también dará lugar a la aparición de pequeñas gotitas de aceite. Algunas gotas de aceite pueden permanecer asociado con el óvulo maduro que afectará a los resultados experimentales y calidad de imagen. Si el aceite no se desplaza de la adición inicial de repetición de tampón de activación pasos 5,4-50.6. Una vez que el aceite se desplaza con éxito, permitirá a las series de tiempo hasta su finalización. Nota: Debido a la hinchazón de los ovocitos en la activación, algunas cámaras de huevos se moverán de manera espectacular fuera del plano focal o campo de visión después de la adición de tampón de activación. En esta situación, detener la adquisición y montar la siguiente cubreobjetos. Después de la secuencia de imágenes se ha completado la adquisición, guardar los datos. 6. posteriores a la adquisición de Procesamiento de Imágenes Abra el conjunto de datos utilizando Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), o el software de procesamiento de imágenes equivalentes, y seleccione los archivos relevantes para el análisis. Para construir una proyección de los datos adquiridos seleccionar: Imagen> Pilas> Z-proyecto. Seleccionar un comienzo Z-rebanada y una parada de Z-rebanada, por lo general toda la sección. Seleccione un tipo de proyección, usualmente la 'Max Intensidad'. Compruebe casilla 'Todo Marcos de tiempo' para aplicar los ajustes seleccionados para toda la serie. Simás de un canal de fluorescencia ha sido fotografiado, utilice la herramienta de canales para permitir el movimiento entre los colores, hacer un compuesto, o hacer que la escala de grises de la imagen. Seleccionar Imagen> Colores> herramienta de Canales. Para ajustar el brillo de la imagen y contraste seleccione Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste. Para exportar una sola imagen, mover cursor escala de tiempo de fotograma correspondiente y seleccione Archivo> Guardar como> JPEG, o cualquier formato preferido. Seleccione una ubicación y título para el archivo exportado, a continuación, guardar. Nota La velocidad de fotogramas del software de imágenes será requerido para dar una indicación de la hora en la imagen. Para exportar la serie de tiempo como una película, seleccione: Archivo> Guardar como> AVI, a continuación, seleccione la velocidad de fotogramas (~ 7 fotogramas por segundo). Seleccione una ubicación y título para el archivo exportado, a continuación, guardar. Para guardar el archivo en formato ajustado Fiji, seleccione Archivo> Guardar.