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Developmental Biology

Imagens de cálcio na<em> Drosophila</em> At Activation Egg

Published: August 06, 2016
doi:
10.3791/54311
, ,
1Department of Zoology,University of Cambridge

Summary

Este artigo descreve um protocolo adaptável ex vivo para a visualização de Ca2 + durante a ativação do ovo em Drosophila.

Abstract

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a ‘Ca2+ wave’. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.

In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Introduction

Uma alteração na concentração intracelular de Ca 2+ em ovo (oócitos) de activação é um componente conservado de todos os organismos estudados 1,2. Este evento inicia uma vasta gama de processos dependentes de Ca 2+, incluindo retomada do ciclo celular e a tradução de mRNAs armazenados. Devido a esta exigência de Ca 2+, visualizando as alterações transitórias em concentrações intracelulares de Ca 2+ tem sido de interesse chave.

Historicamente, foram seleccionados organismos modelo para estudos de activação de ovo com base no tamanho e disponibilidade dos seus ovos. Várias abordagens de visualização têm sido utilizadas para seguir e quantificar as alterações na concentração de Ca2 + intracelular em tais sistemas, incluindo: a aequorina fotoprote�a em medaka peixes 3; Ca 2+ corantes fluorescentes sensíveis, tais como Fura-2 em ouriço-do-mar e hamster 4,5; e cálcio verde-1-dextrano em Xenopus 6.

A geração e melhoria de indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIS) transformou a capacidade de visualizar de Ca2 + dinâmica in vivo 7. Estas construções genéticas são expressas em tecidos específicos e limitar a necessidade de preparações de tecidos invasivos 8.

GCaMPs são uma proteína fluorescente (GFP) classe baseado verde da Gecis que têm sido muito eficaz devido à sua elevada afinidade de Ca2 +, razão e capacidade de sinal-ruído para ser personalizado 9-11. Na presença de Ca2 +, o complexo GCaMP sofre uma série de alterações conformacionais, que começa com a ligação de Ca 2+ para a calmodulina, que resulta em um aumento da intensidade de fluorescência da GFP componente 9.

GCaMPs têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre neurônios Drosophila visualize as alterações de cálcio intracelular 12. Os applicati recenteson da tecnologia GCaMP para visualizar Ca 2+ em ovos de Drosophila maduros revelou uma única transiente de Ca2 + onda de activação de ovo 13,14. A onda de Ca2 + pode ser visualizada a baixa ampliação durante a ovulação in vivo 13 ou em maior ampliação usando um ensaio de activação ex vivo 13,14. No ensaio ex vivo, os oócitos maduros individuais são isolados a partir dos ovários e activado usando uma solução hipotónica, referido como tampão de activação, o que foi mostrado para recapitular eventos de activação in vivo, em 15-17.

Este ensaio ex vivo permite a visualização de alta resolução fácil da onda de Ca2 +, sob diferentes condições experimentais, incluindo perturbação farmacológica, manipulações físicas e mutantes genéticos. Este artigo demonstra a preparação de ovos de Drosophila maduras para a activação ex vivo e The subsequente microscopia usado para visualizar a onda de Ca2 + utilizando GCaMP. Esta abordagem pode ser utilizada para testar a iniciação e controlo da onda de Ca2 + e a sonda resultados jusante.

Protocol

Nota: Realizar todas as medidas à temperatura ambiente, salvo indicação contrária. 1. Preparação para Dissection Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com E. gavis, Universidade de Princeton & Weil et. al. 18. Execute os seguintes passos dois dias antes de imagem. Aqui fly um frasco contendo aproximadamente 10 ml de comida sólida e adicionar uma pequena quantidade de fermento seco para um canto, inferior a 1 g é suficiente. Nota: Para obter informações sobre frascos de voar ou de alimentos ver 'Drosophila Manutenção' 19. Adicionar 1 – 3 gotas de água para hidratar a levedura. Definir o frasco de lado em um ângulo de 45 ° e permitir 3-5 min para a levedura para assumir a água. Enquanto a levedura é a absorção de água, seleccionar uma garrafa de moscas que expressam GCaMP5 MYR UASt- 20 impulsionado por banheira-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que surgiram recentemente (um myristoyforma lada do GCaMP5 foi escolhido para fornecer um sinal de alta-ruído através de amarrar o GECI à membrana dentro do ovo). Anestesiar as moscas na garrafa com gás CO2. Certifique-se de manter a garrafa invertida de modo a não perder moscas na comida húmida. Dica as moscas anestesiados em uma almofada de CO 2 e tipo 10 – 15 mulheres e 5 homens usando um pincel sob um microscópio de dissecação. Nota: É padrão para incluir machos para fornecer fêmeas saudáveis ​​para dissecção. Quando o frasco do passo 1.3 está pronto, adicione as moscas selecionados para o frasco. Tome cuidado para manter a horizontal frasco até que as moscas se tornar ativo. Colocar o frasco a 25 ° C durante aproximadamente 36 h. Retornar as moscas remanescentes do CO 2 pad para a garrafa ou descarte. 2. Dissecting Drosophila Ovário Nota: Os passos descritos aqui estão de acordo com Weil et. ai. <s-se> 18. Após 36 h, anestesiar as moscas do frasco yeasted com CO 2. Uma vez que as moscas dentro do frasco são anestesiados ponta-los para a almofada de CO 2 a ser classificados com um pincel sob um microscópio de dissecação. Selecione uma fêmea. Isolar os dois ovários de fêmea. Para protocolo detalhado completo ver Weil et. al. 18. Em suma: Colocar uma pequena gota de óleo de hidrocarbonetos halogenados oxigenado (série 95) em um n ° s 1.5, 22 x 40 milímetros lamela. Agarrar a fêmea com uma pinça na anterior do abdome. Segurando a fêmea sob o microscópio de dissecação, use o segundo conjunto de pinças para remover suavemente a parte posterior da fêmea. Limpe o tecido posterior do segundo fórceps. Espremer na cavidade abdominal com a segunda pinça do anterior para o posterior do abdómen. Os dois ovários opaco deve ficar para a pinça quando fora da FEMAle. Toque nos ovários no óleo. Remover qualquer tecido do fórceps por limpando os fórceps. Repita essas etapas (2.4.1 – 2.4.7) para obter três lamelas, cada um contendo os ovários de uma mosca. 3. Isolando Individual óvulos maduros Sob um microscópio de dissecação padrão com a ampliação definido para 4X, na primeira lamela a partir do passo 2.4, separar os dois ovários, rasgando a tuba uterina. Introduzir um par de fórceps fechadas para o centro de um único ovário, tomando cuidado para não perfurar quaisquer câmaras de ovo. Insira uma sonda de dissecação padrão para o centro do ovário ao lado das pinças fechadas. Suavemente arrastar a sonda de dissecação através do ovário para o pólo posterior, onde os óvulos maduros (fase 14 câmaras de ovo) estão localizados. Repita os passos 3.1 – 3.4 2-5 vezes, dependendo do tamanho do ovário e do número de ovos. Nota: A adição de CO 2 </sub> normalmente provoca a deposição de um único ovo que aparecerá maior com apêndices dorsais elevado que os ovos depositados previamente. Este ovo deve ser descartado para a imagem latente, uma vez que já foi activado dentro da fêmea. Nota: óvulos maduros são susceptíveis de separar facilmente a partir de tecido conjuntivo de ovário. Se não houver óvulos maduros são visíveis fora do ovário, continue suavemente provocando com a sonda de dissecação. Uma vez que os ovos maduros são visíveis na lamela fora do ovário, manobrar 3-5 numa linha no centro da lamela. Nota: Para obter os melhores resultados, a sonda de correr suavemente ao longo do lado dos ovos. Nota: Evite puxando os apêndices dorsais, pois isso pode danificar o óvulo. Nota: Dependendo do futuro imaging set-up, alinhe os ovos cerca de 200 mm além perpendicular à lamela para a área máxima de imagem. Uma vez alinhados, remover o resto do tecido do ovário, arrastando-a para longe dos ovos alinhadas utilizando o forceps. Retire o excesso de óleo, esfregando com o canto de limpar um médico. Tenha cuidado para não tocar os ovos maduros com o médico limpe ovos, como maduras que são contactadas serão perdidos. Desenhar uma cruz sobre a lamela com um marcador para simplificar a colocar a amostra sob o microscópio. Defina a lamela em um lugar seguro e deixar as câmaras de ovos preparados na lamela para descansar por 5 – 10 min. Isso permite que o ovo se estabelecer no óleo. As amostras podem ser utilizados até 1 h após a dissecação. Repita os passos 3,1-3,11 para o resto das lamelas com ovários sobre eles. 4. Preparar for Imaging Traga tampão de activação preparado para 15 temperatura ambiente. Nota: tampão de activação é um tampão hipotónico: 3,3 mM de NaH 2 PO 4, 16,6 mM de KH 2 PO 4, 10 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5% de polietileno glicol 8000, CaCl2 2 mM, levada a pH 6,4 com uma mistura 1: 5 proporção de NaOH: KOH.Para mais informações ver Mahowald, 1983 15. Alíquotas de tampão de activação pode ser armazenado a -20 ° C durante meses e a 4 ° C durante até 2 semanas. transportar cuidadosamente lamelas preparados, tampão de activação e pipetas de vidro para a instalação de imagem. Nota: Uma de campo amplo, confocal, de disco rotativo ou folha microscópio de luz pode ser utilizado. Recomendamos o uso de um microscópio invertido. Os resultados representativos foram obtidos utilizando um microscópio confocal. Um objectivo adequado para imagiologia de todo o óvulo maduro deve ser escolhida (aqui: 20X 0,7 NA). Montar a primeira lamela preparado para o palco microscópio. Tome cuidado para não quebrar as lamelas no palco. Qualitativamente selecionar um campo de visão com uma câmara de óvulo maduro para a ativação. Do não de imagem perfurada câmaras de ovo ou aqueles com formação de bolhas na membrana. Nota: Para obter etapas 4.6 – 4.7, comandos de software irá variar dependendo do microscópio e fabricante. Set parágrafo imagingmetros para a excitação padrão GFP (488 nm) e emissão (500-580 nm). Também configurar uma vista de campo brilhante, a fim de visualizar e orientar o óvulo maduro e óleo de deslocados. Seleccionar o menor plano z em que os ovos maduros são visíveis e definir um Z-pilha completa para ser levado para 40 um a cerca de 2 mM por passo. Defina os parâmetros para que haja nenhum atraso entre a aquisição Z-stack. Definir a série de tempo para capturar cerca de 30 min. 5. Activação de imagem Ex Vivo ovo Comece a captura da imagem. Espere por 1 – 2 completos Z-stacks a serem adquiridos. Isto mostra o óvulo maduro antes da activação. Retirar cerca de 300 ul de tampão de activação para uma pipeta de vidro. Posicionando a ponta da pipeta de vidro contendo tampão de ativação em um ângulo de 45 ° acima da lamela, mova lentamente a pipeta no caminho do feixe até que esteja diretamente acima do óvulo maduro que está sendo trabalhada. A pipeta de vidro deveser de 1 – 2 cm acima do óleo. Adicionar 1 – 2 gotas de tampão de activação em menos de 5 segundos a partir da pipeta de vidro. Isto deve deslocar o óleo. Evitar a adição de tampão de activação de excesso ou tocar no ovo com a pipeta de vidro, uma vez que pode causar o deslocamento do óvulo maduro. Tome cuidado para não tocar a lamela com a pipeta, pois isso pode causar uma mudança no plano ou bolhas de ar focais a se formar no óleo de imersão entre o objetivo e lamela. Embora a adição de tampão de activação durante a aquisição de imagem, verificar o canal de campo brilhante para assegurar que o óleo tenha sido deslocado pelo tampão de activação. Nota: Isto irá aparecem pela primeira vez como uma sombra devido à pipeta quebra do caminho do feixe, mas também irá resultar no aparecimento de gotas de óleo pequenas. Algumas gotas de óleo pode permanecer associado com o óvulo maduro que irá afectar os resultados experimentais e a qualidade da imagem. Se o óleo não é deslocada a partir da adição inicial de tampão de activação de repetir os passos 5,4-5.6. Uma vez que o óleo é deslocado com sucesso, permitem que a série de tempo para ser executado até a conclusão. Nota: Devido ao inchaço dos oócitos em ativação, algumas câmaras de ovo irá mover drasticamente fora do plano focal ou campo de visão após a adição de tampão de activação. Nesta situação, pare a aquisição e montagem da próxima lamela. Depois da sequência de imagem concluiu aquisição, salvar os dados. 6. Pós-aquisição de Processamento de Imagem Abra o conjunto de dados usando Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji), ou software de processamento de imagem equivalente, e selecione os arquivos relevantes para a análise. Para construir uma projeção dos dados adquiridos selecione: Imagem> Pilhas> Z-projeto. Selecione um começo Z-slice e uma Z-slice parada, geralmente toda a seção. Selecione um tipo de projeção, normalmente definido como 'Max intensidade ". Marque a caixa tick 'All Time Frames "para aplicar as configurações selecionadas para toda a série. E semais de um canal fluorescente foi fotografada, use a ferramenta Canais para permitir o movimento entre as cores, fazer um composto, ou fazer a escala de cinza da imagem. Selecione Imagem> Colors> Canais ferramenta. Para ajustar o brilho eo contraste da imagem, selecione Image> Adjust> Brightness / Contrast. Para exportar uma única imagem, mover controle deslizante escala de tempo para o quadro relevante e selecione Arquivo> Salvar como> JPEG ou qualquer formato preferido. Escolha um local e título para o arquivo exportado, em seguida, salvar. Nota A taxa de quadros a partir do software de imagem será obrigado a dar uma data e hora na imagem. Para exportar a série temporal como um filme selecione: File> Save As> AVI, em seguida, selecione a taxa de quadros (~ 7 quadros por segundo). Escolha um local e título para o arquivo exportado, em seguida, salvar. Para salvar o arquivo no formato ajustado Fiji, selecione Arquivo> Salvar.

Representative Results

Aqui demonstramos como preparar ovos de Drosophila maduros para a activação ex vivo. Ovos expressam um GECI permitir imagens de Ca 2+ dinâmica na activação de ovo e o início do desenvolvimento embrionário (Figura 1). Deve notar-se que, dependendo da GCaMP usado, especificamente a presença de um grupo miristoílo, os resultados podem ter pequenas diferenças qualitativas 13 14. Nós também têm demonstrado um papel para a actina funcional durante a activação do ovo por meio da adição de um inibidor de polimerização de actina, citocalasina D, para o tampão de activação (Figura 2) 14. Um requisito para o citoesqueleto na activação do ovo é conservada. Em C. elegans, após a fertilização, os componentes do citoesqueleto são reorganizados para preparar o embrião de uma célula para a primeira divisão assimétrica 21,22. Em ouriço do mar, a perturbação dos cytoskeleTal re-organização após activação foi mostrado para afectar o ciclo celular, prevenindo a formação do anel 23 contráctil. O papel da actina na mediação de uma onda de Ca2 + e sua função jusante para ativação ovo em Drosophila continua a ser totalmente elucidado. Em Drosophila, o co-visualização da onda do citoesqueleto de actina e de Ca2 + pode ser conseguida utilizando este ensaio de activação ex vivo. Séries temporais de vários canais podem ser adquiridas e dinâmica do Ca2 + intracelular pode ser combinado com mudanças na organização da actina no oócito (Figura 3). Figura 1:. A Single Ca 2+ onda em série Drosophila Egg Activation Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 seguindo a umddition de tampão de activação (AH). O aumento no Ca 2+ citoplasmático origina-se no polo posterior (B) e propaga (BF) com uma velocidade média de cerca de 1,5 um / seg. Iniciação da onda é tipicamente observada dentro de 3 minutos da adição de tampão de activação. Após a activação, os níveis de cálcio intracelular do óvulo maduro retorna aos níveis (G, H) de pré-activação. Veja o filme suplementar 1 (tempo total de 33 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: A adição de citocalasina D da Activação: Tampão perturba Ca2+ Propagação de Ondas. A série da ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 após a adição de tampão de activação contendo / ml concentração final citocalasina D 10 mg (AH). Embora a onda 2+ Ca é iniciada no pólo posterior (A), que é comprometida e não atinge o anterior do ovo (F) (setas brancas indicam a frente da onda). Nenhuma outra Ca 2+ foram observadas alterações ao longo de 30 min). Veja o filme suplementar 2 (total de tempo de 30 min). Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Co-visualização de actina e Ca 2+ em EAtivação gg em série Drosophila. Hora do ex vivo amadurecer ovo Drosophila expressando UASt- myrGCaMP5 (ciano) e UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) após a adição de tampão de activação (AH). O Ca 2+ onda inicia a partir do pólo posterior e recupera como na Figura 1. Actina parece estar mudando ao longo do tempo, as setas brancas (A vs H). A falta de detecção do sinal de Ca2 + no centro do óvulo maduro é devido ao movimento da amostra durante a captura de imagem. Barras de escala = 50 uM. Max projeção = 40 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.

Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.

Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.

This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.

There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya para a assistência durante a preparação deste manuscrito; Mariana Wolfner para discussões sobre a ativação do ovo; Matt Wayland para suporte de imagem; e Nan Hu para apoio geral em laboratório.

Este trabalho foi financiado pela Universidade de Cambridge, ISSF para TTW [número de concessão 097.814].

Materials

Dry active yeast Fleischman’s #2192
Dissecting microscope Leica MZ6 Various will work
Lamp Mircotec Fibre optic MF0-90 Various will work
Medical wipes Kimberly-Clark Corporation KLEW3020 
Marker pen Stabilo 841/46 OHPen universal, black – available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm
CO2 pad  Genesee Scientific 59-114 (789060 Dutscher)
Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T 
Halocarbon oil, series 95 Halocarbon Products Corp. Distributor in Europe:
Solvadis (GMBH)
Oil 10 S VWR Chemicals 24627.188 Can be used instead of Halocarbon oil, series 95
Forceps Fine Science Tools 11252-00 Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient.
Probe Fine Science Tools 10140-01
Glass pipette Fisherbrand, FB50251 Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length 
Vial Regina Industries P1014 GPPS  80mm x 25mm
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References

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Derrick, C. J., York-Andersen, A. H., Weil, T. T. Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation. J. Vis. Exp. (114), e54311, doi:10.3791/54311 (2016).
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