内イメージングカルシウム<em>ショウジョウバエ</em>卵活性化で

注：特に明記しない限り、室温ですべてのステップを実行します。 1.解剖の準備注：ここで説明する手順は、E Gavis、プリンストン大学＆ワイルらに従っています。アル。18。 2日間の撮影前に、次の手順を実行します。 固形食品の約10ミリリットルを含むフライバイアルを取り、1コーナーに乾燥酵母の少量を追加し、1g未満で十分です。 注：フライバイアルまたは食品に関する情報は、「 ショウジョウバエのメンテナンス」19を参照してください。 酵母を水和するために3滴の水 – 1を追加します。 45°の角度で脇バイアルを設定し、3許可 – 水を取るために酵母のための5分。 酵母は水を吸収している間に、最近（myristoyを浮上している浴槽-VP16GAL4（GCaMP5と呼ばれる）によって駆動UASt- マイア GCaMP5 20を発現しているハエのボトルを選択GCaMP5のされた関連の形）が卵に膜にGECIをテザリングを介して、高い信号対雑音比を提供するために選ばれました。 CO 2ガスを瓶の中にハエをAnaesthetize。ウェットフードでハエを失わないように、倒立ボトルを保つようにしてください。 CO 2パッドの上に麻酔ハエヒントとソート10から15人の女性と解剖顕微鏡下で絵筆を使用して5人の男性。注：解剖のための健康的なメスを提供するために、男性を含めるための規格です。 ステップ1.3からのバイアルの準備ができたら、バイアルに選択されたハエを追加します。ハエがアクティブになるまでバイアル水平を保つように注意してください。 約36時間、25℃でバイアルを置きます。 ボトルや廃棄にCO 2パッドから残りのハエを返します。 2.解剖ショウジョウバエ卵巣注：ここで説明する手順は、ワイルらに従っています。アル。 <s> 18アップ。 36時間後、CO 2とyeastedバイアルからハエをanaesthetize。 バイアル内部のハエを麻酔したら、解剖顕微鏡下でペイントブラシでソートするCO 2パッドの上にそれらを傾けます。 女性を選択します。 女性からの2の卵巣を分離します。完全な詳細なプロトコールについてはワイルらを参照してください。アル。18。要約すれ​​ば： 第1.5、22×40ミリメートルカバースリップ上の酸素ハロカーボンオイル（シリーズ95）の小滴を置きます。 腹部の前で鉗子で女性をつかみます。 解剖顕微鏡下で女性を持ち、優しく女性の後部を削除するには、鉗子の第2のセットを使用します。 第二の鉗子から後方組織を拭き取ってください。 前方から腹部の後方への第2の鉗子を用いて腹腔に絞ります。時FEMAの外側にある半透明の卵巣が鉗子に固執する必要がありますル。 油に卵巣をタッチします。 鉗子を拭き取ることにより、鉗子から任意の組織を削除します。 3カバースリップ、1 flyから卵巣を含む各を得るために – これらの手順（2.4.7 2.4.1）を繰り返します。 3.単離個々の熟卵 4Xに設定倍率の標準的な解剖顕微鏡下では、ステップ2.4​​からの最初のカバースリップ上で、卵管を引き裂くことにより、2つの卵巣を分離します。 任意の卵室を穿刺しないように注意しながら、単一の卵巣の中央に閉じたピンセットをご紹介します。 次の閉じた鉗子に卵巣の中心​​部への標準的な解剖プローブを挿入します。 ゆっくり成熟卵（ステージ14卵室）が配置された後極に向かって卵巣を介して解剖プローブをドラッグします。 繰り返しは3.1ステップ – 3.4 2から5回は卵巣と卵の数のサイズによって異なります。 注：CO 2の追加</サブ>は、通常、予め堆積卵よりも隆起した背の付属と大きく表示されます単一の卵の堆積を引き起こします。それは既に女性の内部で起動されているので、この卵は、イメージングのために破棄されるべきです。 注：成熟卵は卵巣結合組織から容易に分離する可能性があります。 全く成熟した卵は卵巣の外側に表示されていない場合、解剖プローブとからかっ優しく続けます。 カバースリップの中央に一列に5 – 成熟した卵子が卵巣の外側カバースリップ上に表示されたら、3を操縦。 注：最良の結果を得るために、穏やかに卵の側面に沿ってプローブを実行します。 注：これは卵に損傷を与えることができるよう背付属を引っ張ることは避けてください。 注：将来のイメージングセットアップに応じて、最大撮影領域のためのカバーガラスに垂直に200μm程度離れて卵を合わせます。 整列一度、Fを使用して整列卵から離れて、それをドラッグすることで、卵巣組織の残りの部分を削除しますorceps。 ワイプ医療のコーナーで軽くたたくことにより、余分な油を削除します。医療が接触するなどの成熟卵を拭くと成熟卵を触れないように注意してくださいが失われます。 顕微鏡下でのサンプルの位置を簡単にするためにマーカーでカバースリップ上の十字線を描画します。 安全な場所にカバーグラスをセットし、5休まカバースリップ上に準備された卵室を残す – 10分。これは、油中に解決する卵を可能にします。試料は、1時間後の切開まで使用することができます。 それらの上に卵巣とカバースリップの残りのための3.11 – を繰り返して、3.1を繰り返します。 4.イメージングのための準備室温に準備されたアクティベーションバッファ15を持参してください。 注：活性化緩衝液は低張性緩衝液である：3.3ミリモルのNaH 2 PO 4、16.6 mMのKH 2 PO 4、10mMの塩化ナトリウム、50mMのKClを、5％のポリエチレングリコール8,000は、2mMのCaCl 2を 、1を用いてpHを6.4にしました。 NaOHを5比：KOH。詳細についてはMahowald、1983年15を参照してください。活性化緩衝液のアリコートを2週間までヶ月と4℃で-20℃で保存することができます。 慎重イメージング施設に準備されたカバースリップ、活性化バッファー及びガラスピペットを輸送。 注：広視野共焦点、スピニングディスク又は光学シート用顕微鏡を使用することができます。私たちは、倒立顕微鏡を使用することをお勧めします。私たちの代表的な結果は、共焦点顕微鏡を用いて得ました。 全体の成熟卵を画像化するのに適した目的は、（ここでは：20X 0.7 NA）を選択すべきです。 顕微鏡ステージ上に最初に準備されたカバースリップをマウントします。ステージ上にカバースリップを壊さないように注意してください。 定性的には活性化のための成熟した卵室でビューのフィールドを選択します。画像は卵室または膜中のブレブ形成を有するものがパンクしないでください。 注意：手順4.6について – 4.7、ソフトウェアコマンドは、顕微鏡やメーカーによって異なります。 設定された撮影パラ（ – 580から500nm）標準GFPの励起（488 nm）を発光のためメートル。また、成熟した卵と変位油を可視化し、配向するために、明視野ビューを設定。 成熟卵が表示されている最低のZ平面を選択し、ステップ当たり40マイクロメートルで約2μmのために取られるフルZスタックを設定します。 Zスタックの取得の間に遅延がないようにパラメータを設定します。約30分間キャプチャする時系列を設定します。 5.イメージングex vivoで卵活性化画像キャプチャを開始します。 取得する2フルZ-スタック – 1のを待ちます。これは、活性化の前に成熟した卵子を示しています。 ガラスピペットに活性化バッファーの約300μLを撤回。 それは成熟した卵は、撮像されているの真上になるまでカバースリップ上記45°の角度で活性化緩衝液を含むガラスピペットの先端を位置決めし、ゆっくりとビーム経路にピペッ​​トを移動します。ガラスピペットべきオイルより2センチメートル – 1です。 ガラスピペットから5秒未満で活性化緩衝液の2滴 – 1を追加します。これは、オイルを置換する必要があります。それは成熟卵の移動を引き起こすことができるように、過剰な活性化緩衝液を追加したり、ガラスピペットで卵に触れないようにしてください。これは目的とカバーガラスとの間に液浸油に形成するために、焦点面や気泡の変化を引き起こすことができるようにピペットでカバースリップに触れないように注意してください。 画像取得時に活性化緩衝液を添加しながら、オイルが活性化緩衝液によって変位していることを確認するために、明視野チャンネルを確認してください。 注：これは、最初のビーム経路を壊すピペットによる影として表示されますが、また、小さな油滴の外観になります。一部の油滴は、実験の結果および画像品質に影響を与える成熟した卵子に関連付けられたままにすることができます。 5 – 油を活性化バッファー反復の最初の添加からずれていない場合は5.4ステップ0.6。 油が正常に変位されると、時系列が完了するまで実行することができます。 注：これにより起動時の卵母細胞の膨潤に、いくつかの卵室は、活性化緩衝液を添加すると、ビューの焦点面またはフィールドの外に劇的に移動します。この状況では、取得を停止し、次のカバースリップをマウントします。 画像シーケンスは、買収を完了した後、データを保存します。 6.買収後の画像処理フィジー（http://fiji.sc/Downloads#Fiji）、または同等の画像処理ソフトウェアを使用して、データセットを開き、分析のために、関連するファイルを選択します。 取得したデータの投影を構築するために選択します。画像>スタック> Z-プロジェクトを。 スタートZ-スライスとストップZ-スライス、通常、セクション全体を選択します。一般的に「最大輝度」に設定投射型を選択します。シリーズ全体に選択した設定を適用するチェックボックス「すべての時間のフレーム」を確認してください。 もし複数の蛍光チャネルは、色間の移動を可能にする複合体を作る、または画像のグレースケールを作るためにチャンネルツールを使用して、撮像されました。画像>色>チャンネルツールを選択します。 画像の明るさを調整し、選択画像を対比>>明るさ/コントラストを調整します。 単一のイメージをエクスポートするには、関連するフレームおよび[ファイル]> [名前を付けて保存> JPEG、または任意の好適なフォーマットにタイムスケールスライダーを移動します。 保存し、エクスポートしたファイルの場所とタイトルを選択してください。 イメージングソフトウェアからフレームレートが画像にタイムスタンプを付与するために必要とされることに注意してください。 選択ムービーとして時系列をエクスポートするには：[ファイル]> [名前を付けて保存> AVIファイルを、フレームレート（1秒あたり〜7フレーム）を選択します。 保存し、エクスポートしたファイルの場所とタイトルを選択してください。 フィジー形式で調整されたファイルを保存するには、[ファイル]> [保存します。