סידן הדמיה ב<em> תסיסנית</em> ב ביצת הפעלה
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול לשעבר vivo להתאמה המאפשר הדמיה Ca 2+ במהלך ההפעלה ביצה תסיסנית.
Abstract
Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a ‘Ca2+ wave’. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.
Introduction
שינוי Ca 2 + ריכוז התאי על הפעלת ביצה (ביצית) הוא מרכיב משומר של כל היצורים שנחקרו 1,2. אירוע זה יוזם מגוון רחב של התהליכים התלויים 2+ Ca, כולל חידוש של מחזור התא ותרגום של mRNAs מאוחסן. בשל דרישה זו עבור Ca 2 +, לדמיין את השינויים החולפים בריכוזים תאיים Ca 2 + כבר עניין מפתח.
מבחינה היסטורית, אורגניזמים מודל נבחרו מחקרים על הפעלת ביצה בהתבסס על גודל וזמינות של ביציהן. גישות להדמיה שונות כבר נוצלו לעקוב ולכמת שינויים התאי Ca 2 + ריכוזים במערכות אלה, ובכלל זה: aequorin photoprotein בדגי medaka 3; Ca צבעי ניאון 2 + רגישים כגון פורעה-2 ב קיפוד ים ו אוגר 4,5; וסידן ירוק-1-dextran ב Xenopus 6.
הדור ושיפור אינדיקטורים סידן מקודדים הגנטי (GECIs) שינה את היכולת לדמיין Ca 2+ דינמיקת in vivo 7. הבונה הגנטית אלה באים לידי ביטוי ברקמות ספציפיות ולהגביל את צורך הכנות רקמות פולשנית 8.
GCaMPs הוא חלבון פלואורסצנטי ירוקה (GFP) בכיתה מבוססת של GECIs שהיה מאוד יעיל, בשל הזיקה הגבוהה Ca 2+ שלהם, יחס אות לרעש ואת היכולת להיות מותאם אישית 9-11. בנוכחות של Ca 2 +, במתחם GCaMP עובר סדרה של שינויים מרחביים, החל עקידת Ca 2+ כדי calmodulin, שתוצאתה היא עוצמת פלורסנט מוגברת של רכיב ה- GFP 9.
GCaMPs נעשה שימוש נרחב במחקר על נוירונים תסיסנית לדמיין שינויי סידן התאי 12. Applicati האחרונהעל הטכנולוגיה GCaMP לדמיין Ca 2 + ביצים תסיסנית בוגרת גילה גל יחיד Ca 2 + חולף על הפעלת ביצה 13,14. גל Ca 2+ ניתן דמיין בהגדלה נמוכה בזמן ביוץ in vivo 13 או בהגדלה גבוהה יותר באמצעות assay הפעלת vivo לשעבר 13,14. ב assay vivo לשעבר, ביציות בוגרות בודדות מבודדות מן השחלות והופעלו באמצעות פתרון hypotonic, המכונה חיץ הפעלה, אשר הוכח לשחזר את אירועי in vivo הפעלת 15-17.
Assay vivo לשעבר זו מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה הקלה של גל Ca 2+ תחת תנאי ניסויים שונים כולל שיבוש תרופתי, מניפולציות פיסיות מוטציות גנטיות. מאמר זה מדגים הכנת ביצים תסיסנית בוגרת vivo לשעבר הפעלה הדואר עוקבת מיקרוסקופיה רגילה לחזות גל Ca 2+ באמצעות GCaMP. גישה זו יכולה לשמש כדי לבחון את החניכה ובקר על גל Ca 2 + ו לחקור תוצאות במורד זרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לורה Bampton, אלכס דוידסון, ריצ'רד פרטון, אריטה Acharya לסיוע במהלך תקופת ההכנה של כתב היד הזה; מריאנה וולפנר לדיונים על הפעלת ביצה; מאט Wayland לתמיכת הדמיה; ונאן הו עבור תמיכה כללית במעבדה.
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת קיימברידג ', ISSF כדי TTW [מספר מענק 097,814].
Materials
| Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
| Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
| Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
| Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black – available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
| Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
| Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
| Solvadis (GMBH) | |||
| Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length |
| Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80mm x 25mm |
References
- Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
- Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
- Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
- Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, 55-67 (2007).
- Douglass, A. . New Techniques in Systems Neuroscience. , (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
- York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
- . Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , (2016).
- Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
- Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).
- Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).
