Görüntüleme Sitometrisi ile İnsan Monosit türetilmiş dendritik hücrelerle Karakterizasyonu: İki Monosit İzolasyon Protokoller Arasında Bir Karşılaştırma
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
Dendritik hücreler (DC), doğal ve adaptif bağışıklık sistemlerinin temel aracılarıdır. Onlar primer immün yanıtları teşvik ve immünolojik hafıza gelişimini kolaylaştırmak için çalışır. Bu hücreler, antijen tutma, taşıma ve T hücre uyarılması için esas olarak sorumlu olan ve bu nedenle, DClerin .Manipulation farklı tedavi etmek için araştırma alanları çok çeşitli boyunca ve klinik ortamda yararlanılabilir 1 profesyonel antijen sunan hücreler (APC'ler) olarak adlandırılır HIV 6,7, kanser 8 gibi enflamatuvar hastalıklar, oto-bağışıklık hastalıkları 9 ve alerjik tepkiler 10. DH'ler ayrıca literatürde alkol bağımlılığı 11-14, ilaç bağımlılığı 13,15 ve HIV enfeksiyonu ve madde kötüye kullanımı, 16-19 kombinasyonu ile ilişkili bilinmeyen ve oluşum mekanizmaları çözmek için Madde Araştırma için kullanılmaktadır. Bu devam eden çalışmalar ve gelecekteki araştırma çalışmaları in immünoloji saha araştırması için son derece önemli DC'ler in vitro nesil olun. Toplam kan tek çekirdekli hücreleri 20% 1 – Bununla birlikte, bir 0,1 teşkil insan kanından DH'lerin izole edilmesine ile ilişkili çeşitli zorluklar bulunmaktadır.
Bugüne kadar, DH'lerin in vitro üretilmesi için iyi bilinen yöntemlerin bazıları, 22 ayırma manyetik aktif hücre, floresan aktive hücre sınıflandırma Monositler 21,22 plastik ya da cam yapışması, yoğunluk gradyanlı santrifüj 23, spesifik bir işaretleyici göre ayrılması oluşmaktadır 24, dekstran-kaplı manyetik nanopartiküller 25 ve tam otomatik negatif hücre seçimi 26 ile yüksek oranda saflaştırılmış monositlerin hızlı izolasyon kullanılarak CD14 + monositler pozitif seçim. Ancak, seçim en iyi yöntemi tartışmalıdır. Bu nedenle, DC oluşturma teknikleri geliştirmek için, çeşitli yöntemler hangi geliştirilmiştirBu hücrelerin saflığı önemli ölçüde, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), 27 ile izole edilmiş, saflaştırılmış CD34 + projenitör hücreleri ve monositler farklılaşmanın arttırılabilir. Önce belirtildiği gibi, monosit türevli dendritik hücreler (MDDCs) üretmek için yaygın olarak kullanılan bir ve popüler bir yöntem cam veya plastik (yapışma yöntemi) 21,22,27 uymaları monositlerin yeteneğini keşfetmek olduğunu. yapışma yöntemi, karmaşık ekipman kullanımının gerektirmeyen, hızlı ve basit bir yöntemdir. Ancak, bu sürecin bazı dezavantajları lenfosit kirlenme, düşük esneklik ve monosit geçici manipülasyon 28 arasındadır. Yapışma yönteme alternatif bir yöntem, özel olarak negatif seçim 26 tarafından PBMC'lerden monositleri izole etmek için tasarlanmış olan bir insan monosit zenginleştirme kiti kullanılarak toplam PBMC'lerden monositler manyetik izolasyondur. Bu işlem sırasında, istenmeyen hücrelere tetramerik ile çıkarılması için hedeflenirantikor komplekslerinden ayrılmakta ve dekstran-kaplı manyetik parçacıklar. Bu izolasyon yönteminin avantajı, istenmeyen etiketli hücreler hedef hücreler serbest sütun gerek olmadan yeni bir tüp içine boşaltılır edilebilir ise bir mıknatıs kullanılarak ayrıştırılmasıdır. Bugüne kadar, benzersiz bir hücre popülasyonu etiket spesifik monoklonal antikorların mevcudiyeti, manyetik ayırma tekniği ek bir yöntem, ancak immünoloji alanında az hücrelerin izolasyonu için bir zorunluluk değildir, sadece olmuştur. Örneğin, manyetik hücre gibi teknikler araştırma ve klinik uygulamaları 22,29 için yeni yaklaşımların gelişmesine olanak sağlamıştır piyasada mevcut paramanyetik MACS-nanopartiküller ile sıralama. Ayrıca, monosit bağlılık ve MACS teknoloji yöntemleri DC nesil karşılaştıran son araştırmalar monositler 22,30 ayrılmış MACS kullanarak daha yüksek bir DC saflık ve canlılığı ortaya koymuştur.
Bu çalışma sunarticari bir insan monosit zenginleştirme kiti kullanılarak yapışma 1), monosit izolasyonu ve 2), monosit izolasyon negatif seçim kriteri: PBMC'lerden izole monositlerde insan DH'lerinin üretimi için iki yöntem arasındaki karşılaştırması. Bu çalışma, yapışma yöntemiyle izole edilmiş monositler ile karşılaştırıldığında monositlerin izole etmek için negatif seçim manyetik ayırma işlemi monosit yaşam kabiliyetinde önemli bir farklılıklar ile monositlerin yüksek verim oluşturur dair kanıt sağlar. Buna karşılık, yedi gün sonra, manyetik ayırma ile izole monositler MDDC canlılığı etkilemeden anlamlı olarak daha yüksek çoğalma kapasitesi ve çift pozitif (CD11c + / CD14 +) fenotip sentezleyen hücrelerin yüksek miktarda MDDCs ayrışmıştır. aynı anda çoğalan ve CD11c ayırma yöntemi edebilen monositleri üretmek için her iki tekniğin becerisi gösterir çünkü genel olarak, bu çalışma + Yukarıda atıfta bulunulan önceki çalışmalardan farklıyaşama yetenekleri tehlikeye sokulmadan kültür içinde yedi gün sonra MDDCs (>% 70). Buna ek olarak, mevcut yaklaşım sitometri görüntüleme akışı ile farklı CD11c / CD14 MDDCs popülasyonlarının ilk kez karakterizasyonu sağlar.
DC'ler immünoloji alanında araştırma ile ilgili bir odak noktası rolü oynamaya beri elde edilir ve hangi yöntemleri in vitro onları izole ve kültür için nasıl kullanıldığını göz önüne alındığında Özetle, farklı parametreler dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, bu çalışmada iki farklı monosit izolasyon yöntemleri ve nasıl bu yöntemler farklı olarak sonunda dendritik hücre canlılığı, proliferasyon ve fenotip etkileyen monosit canlılığını ve verimini etkileyen anlayışlar sağlamayı amaçlamaktadır. Bu bulgular immünoloji alanında büyük katkı sağlayacaktır ve DC izolasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu ayrıntılı bir protokol sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
izole edilmesi ve insan kanından MDDCs üretilmesi bilinen zorlukların göre, bu çalışmada MDDCs üretilmesi için iki köklü yöntemlerin bir karşılaştırma sağlamak için amaçlanmıştır. Kıyasla ilk yöntem, cam veya plastik (yapışma yöntemi) 21,22,27 uymaları monositlerin yeteneği yararlanarak MDDCs üretilmesi için iyi bilinen bir geleneksel bir yöntemdir. yapışma kullanım olup, etkili, hızlı ve düşük maliyetli ve karmaşık ekipman kullanımını gerektirmez. Ancak, bu sürec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines – past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus<sup>®</sup>. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. . The American Association of Immunologists (AAI). , (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. . Differential Blood Count. , (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i., Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
