Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Las células dendríticas (DC) son mediadores esenciales de los sistemas inmune innata y adaptativa. Funcionan para inducir respuestas inmunes primarias y facilitar el desarrollo de la memoria inmunológica. Estas células son los principales responsables de captura de antígeno, la migración y la estimulación de las células T y por lo tanto se conocen como células presentadoras de antígenos (APC) profesionales ¹ .Manipulation de países en desarrollo podría ser utilizado en una amplia variedad de campos de investigación y en la práctica clínica para el tratamiento de diferentes enfermedades inflamatorias tales como el VIH ^6,7, cáncer, enfermedades autoinmunes ^{8 9,} y las respuestas alérgicas ^10. DCs también se están utilizando para la investigación de abuso de sustancias con el fin de resolver los mecanismos desconocidos y vías, tales como los asociados con la dependencia del alcohol ^{11 a 14,} la dependencia de drogas ^13,15, y la combinación de la infección y la sustancia VIH abuso ^16-19. Estos estudios en curso y futuros estudios de investigación in el campo de la inmunología hacer en la generación in vitro de los países en desarrollo muy importante para la investigación. Sin embargo, hay varias dificultades asociadas con el aislamiento de las DC a partir de sangre humana, ya que sólo constituyen 0,1 a 1% de las células mononucleares de sangre total ^20.

Hasta la fecha, algunos de los métodos bien establecidos para la generación de DCs in vitro consiste en plástico o vidrio adherencia de monocitos ^21,22, densidad de centrifugación en gradiente de ^23, la separación basada marcador específico tal como de células activadas por clasificación magnética ^22, de células activadas por fluorescencia de clasificación ^24, la selección positiva de los monocitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas recubiertas de dextrano ^25, y el rápido aislamiento de los monocitos altamente purificados usando selección celular negativa totalmente automatizado ^26. Sin embargo, el mejor método de elección sigue siendo controvertido. Por lo tanto, para mejorar las técnicas de generación de corriente continua, varios métodos han sido desarrollados en la quela pureza de estas células se puede aumentar en gran medida por la diferenciación de las células y los monocitos purificados progenitoras CD34 + aisladas a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) ^27. Como se ha mencionado antes, un método ampliamente utilizado y popular para la generación de células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) es explorar la capacidad de los monocitos se adhieran al vidrio o plástico (método de adherencia) ^21,22,27. El método de adherencia es un método rápido y sencillo que no requiere el uso de equipos complejos. Sin embargo, algunas desventajas de este proceso incluyen la contaminación de linfocitos, baja flexibilidad, y monocitos manipulación transitoria ^28. Un método alternativo al método de adhesión es el aislamiento magnético de los monocitos de PBMC totales, en particular con el uso de un kit de monocitos enriquecimiento humano, que está diseñado para aislar los monocitos de PBMC por selección negativa ^26. Durante este procedimiento, las células no deseadas son objeto de extracción con tetraméricacomplejos de anticuerpos y partículas magnéticas recubiertas de dextrano. La ventaja de este método de aislamiento es que las células marcadas no deseadas se separan mediante un imán, mientras que las células diana se pueden verter libremente fuera en un nuevo tubo sin necesidad de columnas. Hasta la fecha, con la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos que pueden etiquetar las poblaciones de células únicas, la técnica de separación magnética se ha convertido en no simplemente un método adicional, sino una necesidad para el aislamiento de células raras en el campo de la inmunología. Por ejemplo, las técnicas tales como clasificación celular magnética con paramagnéticas disponibles comercialmente MACS-nanopartículas han facilitado el desarrollo de nuevos enfoques para la investigación y aplicaciones clínicas ^22,29. Por otra parte, los estudios de investigación recientes que comparan la generación de DC a partir de métodos de adherencia de monocitos y la tecnología MACS han demostrado una mayor pureza y la viabilidad de CC utilizando MACS monocitos ^22,30 separadas.

Los presentes estudios actualesuna comparación entre dos métodos para la generación de DCs humanas de monocitos aislados de PBMC: 1) los monocitos de aislamiento por adherencia y 2) el aislamiento de monocitos por selección negativa utilizando un kit comercial de monocitos enriquecimiento humano. Este estudio proporciona evidencia para demostrar que la selección procedimiento de separación magnética negativa para aislar monocitos genera el mayor rendimiento de monocitos con diferencias significativas en la viabilidad de monocitos en comparación con los monocitos aislados por el método de adherencia. A su vez, después de siete días, los monocitos aislados por separación magnética diferencian en MDDCs con significativamente mayor capacidad de proliferación y una mayor cantidad de células que expresan doble positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo sin afectar MDDC viabilidad. En general, el estudio actual se diferencia de los estudios anteriores mencionadas anteriormente, ya que demuestra la capacidad de ambas técnicas para generar simultáneamente monocitos que son capaces de proliferar y diferenciarse en CD11c +MDDCs (> 70%) después de siete días en cultivo sin comprometer su viabilidad. Además, el enfoque actual prevé la primera caracterización de tiempo / poblaciones diferentes CD11c CD14 MDDCs por el flujo de imágenes citometría.

En resumen, ya que los países en desarrollo desempeñan un papel central en relación con la investigación en el campo de la inmunología, diferentes parámetros deben tenerse en cuenta a la hora de considerar cómo se han obtenido y qué métodos se utilizan para aislar y cultivar en vitro. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo proporcionar información sobre dos diferentes métodos de aislamiento de monocitos y cómo estos métodos afectan diferencialmente la viabilidad de monocitos y el rendimiento con el tiempo afecta a la viabilidad de células dendríticas, proliferación y fenotipo. Estos hallazgos contribuirán en gran medida al campo de la inmunología y proporcionarán un protocolo detallado de DC aislamiento, purificación y caracterización.