Характеристика человека моноцитов дендритные клетки путем обработки изображений проточной цитометрии: Сравнение между двумя моноцитов Isolation протоколов

Дендритные клетки (ДК) являются важными медиаторами врожденной и адаптивной системы иммунитета. Они действуют, чтобы вызвать первичные иммунные реакции и способствуют развитию иммунологической памяти. Эти клетки в первую очередь ответственны за захват антигена, миграции и стимуляции Т – клеток и, следовательно , называют профессиональных антиген – представляющих клеток (АРС) ¹ .Manipulation ДК могут быть использованы в самых различных областях исследований и в клинических условиях для лечения различных воспалительных заболеваний , таких как ВИЧ , ^6,7, рак ^8, аутоиммунные заболевания ^9, а также аллергические реакции ^10. Контроллеры домена также используются для исследования злоупотреблением вещества для того , чтобы решить неизвестные механизмы и пути , такие как те , которые связаны с алкогольной зависимостью ^11-14 наркотической зависимости ^13,15, и сочетание инфекции и наркомании ВИЧ ^16-19. Эти текущие исследования и будущие научные исследования Iп области иммунологии делают в пробирке поколения РС чрезвычайно важны для исследования. Тем не менее, существуют некоторые трудности , связанные с выделением контроллеров домена из крови человека , поскольку они составляют лишь 0,1 – 1% от общего количества мононуклеарных клеток крови ^20.

На сегодняшний день некоторые из хорошо известных методов для генерации РС экстракорпорального состоит из пластика или стекла адгезии моноцитов ^21,22, центрифугирования в градиенте плотности ^23, удельная разделения на основе маркеров , таких как магнитная активированной сортировки клеток ^22, флуоресцентная сортировка клеток ^24, положительный выбор CD14 + моноцитов с использованием декстрана покрытием магнитных наночастиц ²⁵ и быстрое выделение высокоочищенных моноцитов с использованием полностью автоматизированной негативной селекции ²⁶ клеток. Тем не менее, лучшим методом выбора остается спорным. Таким образом, для улучшения методов генерации постоянного тока, несколько методов были разработаны, в которыхЧистота этих клеток может быть значительно увеличена путем дифференцировки из очищенных CD34 + клеток – предшественников и моноцитов , выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) ^27. Как упоминалось до, широко используемый и популярный метод для генерации моноцитов дендритных клеток (MDDCs) заключается в изучении способности моноцитов придерживаться стекла или пластика (метод спаек) ^21,22,27. Метод прилипание является быстрым и простым способом, который не требует использования сложного оборудования. Тем не менее, некоторые недостатки этого процесса включают загрязнение лимфоцит, низкую гибкость и моноцитов переходную манипуляцию ^28. Альтернативный метод метода прилипание магнитная изоляция моноцитов от общего МНПК, в частности , с использованием человеческого набора обогащения моноцитов, который предназначен для выделения моноцитов МНПК путем негативного отбора ^26. Во время этой процедуры нежелательные клетки предназначены для удаления с тетрамернойантитело и магнитные частицы, покрытой декстраном. Преимущество этого способа выделения является то, что нежелательные меченые клетки отделяются с помощью магнита в то время как клетки-мишени могут быть свободно слили в новую пробирку без необходимости колонн. На сегодняшний день, при наличии специфических моноклональных антител, которые могут маркируют уникальные клеточные популяции, метод магнитной сепарации становится не просто дополнительный метод, а необходимость для выделения редких клеток в области иммунологии. Например, методы , такие как магнитно сортировки клеток с коммерчески доступными парамагнитных MACS-наночастиц способствовали разработке новых подходов для проведения исследований и клинических применений ^22,29. Кроме того, последние научные исследования , сравнивающие поколение постоянного тока от прилипания моноцитов и технологии MACS методы продемонстрировали более высокую чистоту и жизнеспособность DC с использованием MACS разделенных моноциты ^22,30.

Настоящее исследование представляетсравнение между двумя методами генерации человеческих моноцитов из ГЦ, выделенных из МНПК: 1) моноцитов изоляции путем присоединения и 2) моноцитов изоляции путем негативной селекции с использованием коммерческого набора обогащения моноцитов человека. Это исследование свидетельствует о том, чтобы показать, что отрицательная магнитная процедура разделения выбора для выделения моноцитов генерирует наибольший выход моноцитов без каких-либо существенных различий в жизнеспособности моноцитов по сравнению с моноцитами, выделенных методом прилипания. В свою очередь, через семь дней, моноциты, выделенные магнитной сепарации дифференцировались в MDDCs со значительно более высоким пролиферативным потенциалом и более высоким количеством клеток, экспрессирующих дважды положительных (CD11c + / CD14 +) фенотипа, не затрагивая жизнеспособность MDDC. В целом, данное исследование отличается от предыдущих исследований, упоминаемых выше, так как он демонстрирует способность обоих методов, чтобы одновременно генерировать моноциты, которые способны пролиферировать и дифференцироваться в CD11c +MDDCs (> 70%) после семи дней в культуре без ущерба для их жизнеспособности. Кроме того, в настоящее время подход предусматривает впервые характеристики различных популяций CD11c / CD14 MDDCs методом проточной цитометрии изображений.

Таким образом, так как контроллеры домена играют роль фокусного отношении проведения исследований в области иммунологии, различные параметры должны быть приняты во внимание при рассмотрении вопроса о том , как они получены , и какие методы используются для выделения и культуры их в пробирке. Таким образом, данное исследование направлено на дать представление о двух различных методов выделения моноцитов и как эти методы дифференцированно влияют на жизнеспособность моноцитов и выход в конечном счете, затрагивающего дендритных жизнеспособность клеток, пролиферации и фенотип. Эти результаты будут в значительной степени способствовать области иммунологии и предоставит подробный протокол постоянного выделения, очистки и характеристики.