Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

As células dendríticas (CDs) são mediadores essenciais dos sistemas imunitários inato e adaptativo. Eles funcionam para induzir respostas imunitárias primárias e facilitar o desenvolvimento de memória imunológica. Estas células são os principais responsáveis para a captura de antígeno, migração e estimulação das células T e, portanto, são chamados de células apresentadoras de antígenos, como profissionais (APCs) ¹ .Manipulation de DCs poderiam ser utilizados em uma ampla variedade de campos de pesquisa e na prática clínica para o tratamento diferente doenças inflamatórias, tais como o VIH ^{6,7, 8} cancro, doenças auto-imunes, ⁹ e ¹⁰ respostas alérgicas. DCs também estão sendo usados para a investigação de abuso de substâncias, a fim de resolver os mecanismos desconhecidos e vias, tais como aqueles associados à dependência de álcool ^11-14, dependência de drogas ^13,15, ea combinação de infecção e abuso de substâncias HIV ^16-19. Estes estudos em curso e futuros estudos in campo da imunologia fazer na geração in vitro de DCs extremamente importante para a investigação. No entanto, existem várias dificuldades associadas com o isolamento de DC a partir do sangue humano como elas constituem apenas 0,1-1% do total de células mononucleares de sangue ^20.

Até à data, alguns dos métodos bem estabelecidos para a geração de DC in vitro consiste em plástico ou vidro aderência de monócitos ^21,22, centrifugação em gradiente de densidade de ^23, a separação com base marcador específico, tais como triagem de células activadas magnética ^22, triagem de células activadas fluorescentes ^24, a selecção positiva de monócitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas revestidas com dextrano ^25, e isolamento rápido de monócitos altamente purificados através de selecção celular negativa totalmente automatizado ^26. No entanto, o melhor método de escolha permanece controverso. Portanto, para melhorar as técnicas de geração de DC, vários métodos têm sido desenvolvidos nos quaiso grau de pureza destas células pode ser aumentada pela diferenciação de células progenitoras CD34 + purificadas e os monócitos isolados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) ^27. Como mencionado antes, um método amplamente utilizado e popular para a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) é explorar a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) ^21,22,27. O método de aderência é um método rápido e simples que não requerem o uso de equipamento complexo. No entanto, algumas desvantagens deste processo incluem a contaminação de linfócitos, baixa flexibilidade, e monócitos manipulação transitória ^28. Um método alternativo para o método de aderência é o isolamento magnético de monócitos a partir de PBMC totais, particularmente com o uso de um kit de enriquecimento de monócitos humanos, que se destina a isolar os monócitos a partir de PBMC por selecção negativa ^26. Durante este procedimento, as células não desejadas são dirigidos para a remoção com tetraméricacomplexos de anticorpo e as partículas magnéticas revestidas com dextrano. A vantagem deste método de isolamento é que as células marcadas não desejados são separados usando um íman enquanto as células alvo podem ser vertida livremente fora para um novo tubo sem a necessidade de colunas. Até à data, com a disponibilidade de anticorpos monoclonais específicos que pode marcar populações de células únicas, a técnica de separação magnética tornou-se não só de um método adicional, mas também uma necessidade para o isolamento de células raras no campo da imunologia. Por exemplo, técnicas como a célula magnética triagem com paramagnéticas MACS-nanopartículas disponíveis comercialmente têm facilitado o desenvolvimento de novas abordagens para a investigação e aplicações clínicas ^22,29. Além disso, estudos recentes que compararam geração de DC a partir de métodos de aderência de monócitos e tecnologia MACS têm demonstrado uma maior pureza DC e viabilidade usando MACS monócitos ^22,30 separados.

Os presentes estudos atuaisuma comparação entre dois métodos para a geração de DC humanas a partir de monócitos isolados a partir de PBMC: 1) isolamento de monócitos por adesão e 2) isolamento de monócitos por selecção negativa utilizando um kit comercial de enriquecimento de monócitos humanos. Este estudo fornece evidências para mostrar que o processo de separação negativa selecção magnética para isolar monócitos gera o maior rendimento de monócitos com nenhuma diferença significativa na viabilidade de monócitos, quando comparados com os monócitos isolados pelo método de aderência. Por sua vez, depois de sete dias, os monócitos isolados por separação magnética diferenciada em MDDCs com significativamente maior capacidade proliferativa e maior quantidade de células que expressam duplo positivo (CD11c + / CD14 +) fenótipo sem afectar a viabilidade MDDC. No geral, o presente estudo difere dos estudos anteriores referidos acima, uma vez que demonstra a capacidade de ambas as técnicas para gerar, simultaneamente, os monócitos que são capazes de proliferar e de se diferenciar em CD11c +MDDCs (> 70%) após sete dias em cultura, sem comprometer a sua viabilidade. Além disso, a abordagem actual fornece pela primeira vez caracterização de diferentes populações CD11c / CD14 MDDCs por citometria de fluxo de imagem.

Em resumo, uma vez que as DCs desempenhar um papel central em relação à investigação no domínio da imunologia, diferentes parâmetros devem ser tomadas em consideração quando se considera como eles são derivados e métodos que são utilizados para isolar e cultivar-los in vitro. Portanto, este estudo tem como objetivo fornecer informações em dois métodos diferentes de isolamento de monócitos e como esses métodos afetam diferencialmente viabilidade de monócitos e de rendimento, eventualmente, afetar a viabilidade das células dendríticas, proliferação e fenótipo. Estes resultados irão contribuir significativamente para o campo da imunologia e irá proporcionar um protocolo detalhado de DC isolamento, purificação, e caracterização.