Caratterizzazione delle derivate da monociti cellule dendritiche umane di Citometria a Flusso Imaging: un confronto tra due protocolli di isolamento dei monociti

Le cellule dendritiche (DC) sono mediatori essenziali del sistema immunitario innato e adattativo. La loro funzione di indurre risposte immunitarie primari e facilitare lo sviluppo della memoria immunologica. Queste cellule sono i principali responsabili per la cattura l'antigene, la migrazione e la stimolazione delle cellule T e sono quindi indicati per le cellule presentanti l'antigene come professionali (APC) ¹ .Manipulation delle DC potrebbe essere utilizzato in una vasta gamma di settori di ricerca e in ambito clinico per il trattamento di diverse malattie infiammatorie come l'HIV ^6,7, il cancro, le malattie autoimmuni ^{8 9,} e le risposte allergiche ^10. DC sono anche utilizzati per la ricerca abuso di sostanze al fine di risolvere i meccanismi sconosciuti e percorsi, come quelli associati con la dipendenza da alcol ^11-14, tossicodipendenza ^13,15, e la combinazione di infezione da HIV e abuso di sostanze ^16-19. Questi studi in corso e studi di ricerca future In campo dell'immunologia fare in vitro generazione delle DC estremamente importante per la ricerca. Tuttavia, vi sono diverse difficoltà legate isolare cellule dendritiche dal sangue umano come costituiscono solo lo 0,1 – 1% delle cellule totali mononucleari del sangue ^20.

Ad oggi, alcune delle tecniche comunemente per la generazione di cellule dendritiche in vitro costituito da plastica o vetro aderenza dei monociti ^21,22, densità centrifugazione in gradiente ^23, specifica separazione basato marcatore come cellula magnetica attivato smistamento ^22, fluorescente cellule attivate classificare ^24, selezione positiva dei monociti CD14 + utilizzando nanoparticelle magnetiche rivestite destrano ^25, e un rapido isolamento dei monociti altamente purificati mediante selezione cellulare negativa completamente automatizzato ^26. Tuttavia, il miglior metodo di scelta rimane controverso. Pertanto, per migliorare le tecniche di generazione di DC, vari metodi sono stati sviluppati in cuila purezza di queste cellule può essere notevolmente aumentata di differenziazione da cellule CD34 + progenitrici purificati e monociti isolati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ^27. Come accennato prima, un metodo ampiamente utilizzato e popolare per la generazione di monociti derivati da cellule dendritiche (MDDCs) è quello di esplorare la capacità dei monociti di aderire al vetro o plastica (metodo di aderenza) ^21,22,27. Il metodo aderenza è un metodo rapido e semplice che non richiede l'uso di attrezzature complesse. Tuttavia, alcuni svantaggi di questo processo includono contaminazione linfociti, scarsa flessibilità, e monociti manipolazione transitoria ^28. Un metodo alternativo al metodo aderenza è l'isolamento magnetico di monociti da PBMC totali, in particolare con l'uso di un kit monociti arricchimento umano, che è progettato per isolare monociti da PBMC da selezione negativa ^26. Durante questa procedura, le cellule indesiderate sono mirati per la rimozione con tetramericcomplessi di anticorpi e particelle magnetiche rivestite destrano. Il vantaggio di questo metodo di isolamento è che le cellule marcate indesiderate vengono separati usando un magnete mentre le cellule bersaglio possono essere liberamente versato fuori in un nuovo tubo senza bisogno di colonne. Ad oggi, con la disponibilità di specifici anticorpi monoclonali che possono etichettare popolazioni cellulari unici, la tecnica di separazione magnetica è diventata non semplicemente un ulteriore metodo, ma una necessità per l'isolamento di cellule rare nel campo della immunologia. Per esempio, tecniche come la cellula magnetica ordinamento con disponibili in commercio paramagnetiche MACS-nanoparticelle hanno facilitato lo sviluppo di nuovi approcci per la ricerca e applicazioni cliniche ^22,29. Inoltre, studi recenti ricerche che confrontano generazione DC dai metodi monociti aderenza e la tecnologia MACS hanno dimostrato una maggiore purezza DC e la vitalità usando MACS monociti ^22,30 separati.

I regali studioun confronto tra due metodi per la generazione di cellule dendritiche umane da monociti isolati da PBMC: 1) isolamento monociti da aderenza e 2) isolamento dei monociti di selezione negativa utilizzando un kit commerciale monociti arricchimento umano. Questo studio fornisce la prova per dimostrare che la procedura di selezione separazione magnetica negativa per isolare monociti genera il più alto rendimento dei monociti senza differenze significative nei monociti vitalità se confrontato con monociti isolati con il metodo di aderenza. A sua volta, dopo sette giorni, i monociti isolati da separazione magnetica differenziate in MDDCs con significativamente più alta capacità proliferativa e una maggiore quantità di cellule che esprimono doppio positivo (+ CD11c / CD14 +) fenotipo senza influenzare MDDC vitalità. Nel complesso, questo studio si differenzia dai precedenti studi citati sopra in quanto dimostra la capacità di entrambe le tecniche per generare simultaneamente monociti che sono in grado di proliferare e differenziarsi in CD11c +MDDCs (> 70%) dopo sette giorni di coltura senza compromettere la loro vitalità. Inoltre, l'attuale approccio fornisce per la prima volta la caratterizzazione di differenti CD11c / CD14 popolazioni MDDCs dal flusso di imaging citometria.

In sintesi, poiché DC giocano un ruolo centrale riguardante la ricerca nel campo della immunologia, diversi parametri devono essere presi in considerazione quando si considera come sono derivate e quali metodi sono utilizzati per isolare e cultura li in vitro. Pertanto, questo studio mira a fornire approfondimenti su due diversi metodi di isolamento dei monociti e di come questi metodi influenzano in modo differenziale monociti vitalità e la resa alla fine colpisce la vitalità delle cellule dendritiche, la proliferazione, e fenotipo. Questi risultati contribuiranno notevolmente al campo della immunologia e forniranno un protocollo dettagliato di DC isolamento, purificazione e caratterizzazione.