Charakterisierung von humanen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen durch Imaging Durchflusszytometrie: Ein Vergleich zwischen zwei Monozyt Isolation Protokolle

Dendritische Zellen (DCs) sind wesentliche Vermittler der angeborenen und adaptiven Immunsystem. Sie funktionieren auf primäre Immunantworten induzieren und die Entwicklung von immunologischen Gedächtnisses erleichtern. Diese Zellen sind in erster Linie verantwortlich für die Antigen – capture, Migration und T – Zell – Stimulation und werden daher als professionelle Antigen präsentierende Zellen bezeichnet (APCs) ¹ .Manipulation von DCs in einer Vielzahl von Forschungsfeldern und im klinischen Umfeld verwendet werden könnte , anders zu behandeln Entzündungserkrankungen wie HIV ^6,7, Krebs ^8, Autoimmunerkrankungen ⁹ und allergische Reaktionen ^10. DCs sind auch für Drogenmissbrauch Forschung eingesetzt, um unbekannte Mechanismen und Wege zu lösen , wie sie im Zusammenhang mit Alkoholabhängigkeit ^11-14, Drogenabhängigkeit ^13,15, und die Kombination von HIV – Infektionen und Drogenmissbrauch ^16-19. Diese laufenden Studien und zukünftige Studien in auf dem Gebiet der Immunologie machen in vitro Generierung von DCs extrem wichtig für die Forschung. Es gibt jedoch einige Schwierigkeiten , die mit DCs aus humanem Blut zu isolieren , da sie nur 0,1 bilden – 1% der gesamten mononuklearen Blutzellen ^20.

Bis heute sind einige der gut etablierten Methoden zur Erzeugung von DCs in vitro besteht aus Kunststoff oder Glas , Adhäsion von Monozyten ^21,22, Dichtegradientenzentrifugation ^23, spezifischer Marker basierend Trennung wie magnetische aktivierte Zellsortierung ^22, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung ^24, positive Selektion von CD14 + Monozyten Dextran-beschichteten magnetischen Nanopartikel ²⁵ verwenden und schnelle Isolierung von hoch gereinigten Monozyten vollautomatisierte negativen Zellselektion ²⁶ verwendet wird . Allerdings bleibt die beste Methode der Wahl umstritten. Daher DC Erzeugungstechniken zu verbessern, wurden verschiedene Verfahren entwickelt worden, in denenDie Reinheit dieser Zellen stark durch Differenzierung aus gereinigtem CD34 + Vorläuferzellen und Monozyten , isoliert aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) ²⁷ erhöht werden kann. Wie vor erwähnt, ist ein weit verbreitetes und beliebte Methode für Monozyten – abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) Erzeugen der Fähigkeit der Monozyten zu untersuchen , um Glas oder Kunststoff (Adhärenz – Methode) ^21,22,27 haften. Die Einhaltung Methode ist eine schnelle und einfache Methode, die nicht die Verwendung von komplexer Ausrüstung erfordert. Jedoch enthalten einige Nachteile dieses Verfahrens Lymphozyt Kontamination, eine geringe Flexibilität und Monocyten transient Manipulation ^28. Ein alternatives Verfahren zur Einhaltung Methode ist die magnetische Isolierung von Monozyten aus Gesamt PBMCs, insbesondere bei Verwendung eines menschlichen Monocyten – Anreicherungs Kit, der ²⁶ Monozyten aus PBMCs durch negative Selektion isoliert ausgebildet ist. Während dieses Verfahrens werden unerwünschte Zellen zur Entfernung mit tetrameren gezielteAntikörper-Komplexe und Dextran-beschichtete magnetische Teilchen. Der Vorteil dieser Isolationsmethode besteht darin, daß die unerwünschten markierten Zellen mit Hilfe eines Magneten getrennt werden, während die Zielzellen frei, ohne dass Spalten aus in ein neues Röhrchen gegossen werden. Bis heute mit der Verfügbarkeit von spezifischen monoklonalen Antikörpern, die spezifisch Zellpopulationen, die magnetische Trenntechnik hat etikettieren kann nicht einfach eine zusätzliche Methode, sondern eine Notwendigkeit für die Isolierung von seltenen Zellen in dem Gebiet der Immunologie werden. Beispielsweise Techniken wie magnetische Zellsortierung mit handelsüblichen paramagnetischem MACS-Nanopartikel haben die Entwicklung neuer Ansätze für Forschung und klinische Anwendungen ^22,29 erleichtert. Darüber hinaus haben die jüngsten Studien Forschung Vergleich DC Generation von Monozyten Adhärenz und MACS – Technologie Methoden eine höhere DC – Reinheit und Lebensfähigkeit nachgewiesen MACS getrennt Monozyten ^22,30 verwendet.

Die aktuelle Studie präsentiertEin Vergleich zwischen den zwei Verfahren zur Herstellung von humanen DCs aus Monozyten aus PBMCs isoliert: 1) monocyte Isolierung durch Adhärenz und 2) monocyte Isolierung durch negative Selektion Kommerzielle menschlichen Monocyten Anreicherungs Kit. Diese Studie liefert Hinweise darauf, dass die negative Selektion magnetische Trennverfahren Monozyten erzeugt die höchste Ausbeute an Monozyten keine signifikanten Unterschiede in Monozyten Lebensfähigkeit zu isolieren, wenn sie mit isolierten Monozyten durch die Einhaltung Methode verglichen. Wiederum nach sieben Tagen, die durch magnetische Trennung getrennt Monozyten in MDDCs differenziert mit deutlich höheren proliferative Kapazität und höhere Menge an Zellen, die doppelt positiven (+ CD11c / CD14 +) Phänotyp ohne MDDC Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Insgesamt unterscheidet sich die aktuelle Studie aus den bisherigen Studien oben Bezug genommen wurde, da es die Fähigkeit beider Techniken demonstriert gleichzeitig Monozyten erzeugen, die von wuchernden fähig sind und Differenzierung in CD11c +MDDCs (> 70%) nach sieben Tagen in Kultur ohne ihre Lebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Darüber hinaus bietet der derzeitige Ansatz zum ersten Mal Charakterisierung verschiedener CD11c / CD14 MDDCs Populationen von Abbildungs ​​Durchflusszytometrie.

Zusammengefasst, da DCs eine Brenn Rolle in Bezug auf die Forschung im Bereich der Immunologie spielen, müssen verschiedene Parameter berücksichtigt werden , wenn man bedenkt , wie sie abgeleitet sind und welche sind Methoden verwendet , um sie in vitro zu isolieren und Kultur. Daher zielt diese Studie Erkenntnisse über zwei verschiedene Methoden der Monozyten-Isolierung und wie diese Methoden unterschiedlich Monozyten Lebensfähigkeit und Ausbeute schließlich dendritischen Zellen Lebensfähigkeit, Proliferation zu beeinflussen, und Phänotyp beeinflussen. Diese Ergebnisse werden stark auf dem Gebiet der Immunologie beitragen und ein ausführliches Protokoll der DC-Isolierung, Reinigung und Charakterisierung liefern.