Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

Dendritische cellen (DCs) zijn essentiële mediatoren van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Zij functioneren primaire immuunreacties induceren en de ontwikkeling van immunologische geheugen vergemakkelijken. Deze cellen zijn primair verantwoordelijk voor antigen capture, migratie en T-cel stimulatie en worden derhalve aangeduid als professionele antigeen presenterende cellen (APC's) ¹ .Manipulation van DCs kan worden gebruikt in een breed scala aan onderzoeksgebieden en de klinische setting voor de behandeling van verschillende ontstekingsziekten zoals HIV ^{6,7, 8} kanker, auto-immuunziekten ⁹ en allergische reacties ^10. DC's worden ook gebruikt voor drugsmisbruik onderzoek om onbekende mechanismen en paden, zoals die in verband met afhankelijkheid van alcohol ^11-14, drugsverslaving ^13,15, en de combinatie van HIV-infectie en drugsmisbruik ^16-19 op te lossen. Deze lopende studies en toekomstig onderzoek studies in het gebied van immunologie maken vitro generatie DCs van groot belang voor onderzoek. Er zijn echter een aantal problemen van de isolatie DCs uit menselijk bloed zij slechts 0,1 uitmaken – 1% van de totale mononucleaire cellen ^20.

Tot op heden enkele gevestigde werkwijzen voor het genereren van DCs in vitro uit kunststof of glas hechting van monocyten ^21,22, dichtheid gradiënt centrifugatie ²³ specifieke merker gebaseerde scheiding zoals magnetische geactiveerde celsortering ^22, fluorescent geactiveerde celsortering ^24, positieve selectie van CD14 + monocyten met behulp van dextran beklede magnetische nanodeeltjes ²⁵ en snelle isolatie van sterk gezuiverde monocyten met behulp van volledig geautomatiseerde negatieve celselectie ^26. De beste methode van keuze blijft controversieel. Daarom DC generatietechnieken verbeteren, zijn verschillende methoden ontwikkeld waarbijde zuiverheid van deze cellen sterk vergroten door differentiatie van gezuiverde CD34 + progenitor cellen en monocyten geïsoleerd uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) ^27. Zoals voorafgaand genoemd, een veel gebruikte en populaire werkwijze voor het genereren van monocyten afgeleide dendritische cellen (MDDCs) is het vermogen van monocyten hechten aan glas of kunststof (hechting methode) ^21,22,27 verkennen. De hechting werkwijze is een snelle en eenvoudige methode die het gebruik van complexe apparatuur vereist. Echter enige nadelen van deze werkwijze omvatten lymfocyt besmetting geringe flexibiliteit en monocyt voorbijgaande manipulatie ^28. Een alternatieve methode om de hechting methode is de magnetische isolatie van monocyten van totaal PBMC's, met name het gebruik van een menselijke monocyt verrijking kit, die is ontworpen om monocyten uit PBMC geïsoleerd door negatieve selectie ^26. Tijdens deze procedure worden ongewenste cellen gericht te verwijderen met tetrameerantilichaamcomplexen en dextran-beklede magnetische deeltjes. Het voordeel van deze isolatiewerkwijze is dat de ongewenste gemerkte cellen worden gescheiden met een magneet terwijl doelcellen vrij kan worden afgegoten in een nieuwe buis zonder de noodzaak voor kolommen. Tot op heden, door de beschikbaarheid van specifieke monoklonale antilichamen die unieke celpopulaties kunnen etiketteren, de magnetische scheidingstechniek is geworden, niet alleen een extra methode, maar een noodzaak voor het isoleren van zeldzame cellen op het gebied van immunologie. Bijvoorbeeld technieken zoals magnetische celsortering met een commercieel verkrijgbare paramagnetische MACS-nanodeeltjes hebben de ontwikkeling mogelijk van nieuwe benaderingen voor onderzoek en klinische toepassingen ^22,29. Bovendien hebben recente studies vergelijken DC generatie van monocyten hechting en MACS technologie methoden een hogere DC zuiverheid en levensvatbaarheid aangetoond met behulp van MACS gescheiden monocyten ^22,30.

De huidige studie presenteerteen vergelijking tussen twee werkwijzen voor het genereren van humane DCs van monocyten geïsoleerd uit PBMC: 1) isolatie van monocyt aanhechting en 2) monocyt isolatie door negatieve selectie met behulp van een commerciële kit menselijke monocyt verrijking. Deze studie geeft aanwijzingen dat de negatieve selectie magnetische scheidingswerkwijze om monocyten te isoleren genereert de hoogste opbrengst van monocyten geen significant verschil in de levensvatbaarheid van monocyten in vergelijking met monocyten geïsoleerd door hechting methode. Op zijn beurt, na zeven dagen, de monocyten geïsoleerd door magnetische scheiding onderverdeeld in MDDCs duidelijk hogere prolifereren en grotere hoeveelheid cellen die dubbel positief (CD11c + / CD14 +) fenotype zonder dat MDDC levensvatbaarheid. Kortom, de huidige studie verschilt van de vorige studies bovengenoemde aangezien toont het vermogen van beide technieken gelijktijdig genereren monocyten die kunnen prolifereren en differentiëren tot zijn CD11c +MDDCs (> 70%) na zeven dagen in de cultuur, zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid. Daarnaast is de huidige benadering voorziet voor het eerst karakterisatie van verschillende CD11c / CD14 MDDCs populaties door beeldvorming flowcytometrie.

Kortom, omdat DCs een brandpunt rol ten aanzien van onderzoek op het gebied van de immunologie spelen, verschillende parameters moet rekening worden gehouden bij het overwegen van hoe ze worden afgeleid en welke methoden worden gebruikt voor het isoleren en kweken ze in vitro. Daarom is deze studie heeft tot doel inzicht te verschaffen over twee verschillende methoden van monocyten isolatie en hoe deze methoden differentieel invloed monocyten levensvatbaarheid en de opbrengst uiteindelijk van invloed zijn dendritische levensvatbaarheid van de cellen, proliferatie en fenotype. Deze bevindingen sterk zal bijdragen aan het gebied van immunologie en zal een gedetailleerd protocol van DC isolatie, zuivering en karakterisatie verschaffen.