구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성
Summary
The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.
Abstract
Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.
Introduction
유사 분열 동안, 복제 된 게놈이 염색체 새로 형성된 딸세포 위에 자매 염색 분체의 동일한 분포가되도록하여 셀 적도 구성된다. 염색체 위치 및 분리는 두 개의 반대 중심체에서 발생하는 스핀들 미세 소관에 자신의 첨부 파일에 의해 매개된다. 충실 염색체 분배를 보장 외에도 방추사의 방향은 또한 세포 분열 평면 일을 지시. 세포 분열의 조정 방향은 개발의 여러 단계 동안 조직의 항상성이 필수적이다. 특히, 규제 유사 분열 스핀들의 위치는 휴대 내용의 비대칭 분포 될 수 있습니다 또는 다른 크기 2의 딸 세포를 생산하고 있습니다. 유사 분열 스핀들 조립 및 방향 의향에 시작 협력과 힘 발전소 3,4를 길항 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 생성 된 힘은 B 구성OTH 당기고 미는 힘. 이러한 힘은 세포 외피와 스핀들 주소록에서뿐만 아니라 발 스핀들 내에 모두 기인 한 미소 관 역학뿐만 아니라 분자 모터 및 가교제 (도 1)에 의해 생성 될 수있다.
미세 소관은 세포 외피로서 단단한 구조에 대해 증가 할 때 가압력을 생성 할 수있다. 시스템 내에서 발생하는 총 저항력에 따라이는 유사 분열 스핀들 (낮은 힘)의 재배치가 발생하거나 미세 소관의 좌굴 또는 재앙 (높은 힘) 5-8를 트리거 할 수 있습니다. 길이가 9 미세 소관이 좌굴 강한 결정이므로 누름으로써 생성 될 수 힘의 크기는 미세 소관의 길이에 의존한다. 또한, 하나의 중심체에서 발생한 미세 소관, 다른 중심체 대해 초기 의향에 3,10- 중심체 분리 구동 제안 된 메커니즘을 밀 수있다.
광고에서성장 미세 소관에 의해 생성 된 힘을 추진, 미세 소관이 접촉 단부 셀 피질시 조건은 힘 (11)를 당겨 중재 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 연구 피질 힘 발생기의 조절 활성을 생체 (1) 유사 분열 스핀들의 비대칭 위치 결정을 위해 필요한 것으로 나타났다. 이 당기는 힘에 필수는 (이하 '네인'이라 함) 피질 지역화 세포질 네인, 마이너스 엔드 감독 미세 소관 모터 단백질 8,12,13이다. 예를 들어, 효모, 피질 (14)을 따라 슬라이딩 모터에 의존하는 미세 소관의 미세 소관 격자 결과 대뇌 피질의 네인의 측면 상호 작용을 신진한다. 그러나, 피질 당기는 힘은 미세 소관 8 해중합에 말에 첨부 형성 네인의 기능에 의해 생성 될 수있다. 미세 소관의 수축에 의해 생성 된 에너지는 일반적으로 높은 차수의 힘으로 이어질 수있다 (~ 50 PN (15 참조 </s최대>)) 개별 모터 단백질에 의해 발생되는 힘보다 (~ 7-8 PN (참조. 16)). 해중합 미세 소관에 대뇌 피질의 네인의 최종에 첨부 신진 효모 (17)와 C에 스핀들 위치를 촉진 엘레 13. 모터에 의존하는 슬라이딩 및 미세 소관 해중합 구동 모두 대뇌 피질의 당기는 힘이 협력 또는 생체 내에서 상호 배타적 수 있는지 여부는 현재 알 수없는이다.
미세 소관 가압력과 네인 매개 피질 당기는 힘 이외에, 중심체의 위치는 다수의 다른 단백질에 의해 방추사 내에서 제어된다. 키네신 -5- 모터는, 예를 들면, 외측으로 슬라이딩 힘 18-20의 발생을 초래 평행 극간 소관 링크를 교차 할 수 사량 체로서 존재한다. 키네신-5 모터 가족의 일원은 C.를 제외하고, 연구 모든 진핵 생물의 중심체 분리 및 바이폴라 스핀들 조립에 필요한 엘레 (참고 21에서 검토).
또한, Ase1 / PRC1 가족의 확산 가교제는 생체 내에서 체외 22-27에서 극간 미세 소관의 미세 소관 영역을 중복으로 지역화하는 것으로 알려져있다. 중복 미세 소관 영역의 Ase1 중심의 확장에 의해 생성 된 힘은 시험관 (28, 29)에 키네신-14 매개 슬라이딩 힘을 상쇄 할만큼 크다. 세포에서 Ase1 / PRC1는 스핀들 midzone 25-27,30에 미세 소관 중복 영역 확산 가교제에 의해 발생하는 힘이 크게 스핀들 조직에 기여할 수 있다는 것을 암시 안정적인 형성을 위해 필요하다. 마지막으로, 유사 분열 염색질에서 힘과 kinetochores 다양한 경로 3을 통해 유사 분열 스핀들 어셈블리 및 위치에 영향을 미친다. 이들 구성 요소는 여기에 기재된 재구성 분석법의 일부가 아닌 때문에, 상세히 설명되지 않을 것이다.
jove_content "> 다른 이론은 위에 설명 된 다른 분자 구성 요소와 세력이 주축 조립 및 위치에서 협력하는 방법에 존재하지만, 우리는 정량적 인 이해에서 멀리 아직도이다. 또한 실험에 살아있는 세포에, 정제 된 구성 요소와 생체 외 실험은 강력한를 제공 경로가이 목표를 달성 할 수 있도록. 여기에 우리가 기본 스핀들 유 중수 에멀젼 방울에서 재구성되는 최근 발표 된 방법의 적용 및 확장 버전 (로스 등. 31)에 대한 시각적 가이드를 제공하는로 시작 마이크로 유체 기술을 이용하여 부품의 최소 개수. 구면 방울이 분열 세포에 필적 크기로 생성된다. 이러한 액적 내에 정제 중심체와 튜 불린은 미세 소관 애 역학 연구 생성 및 애 – 애 상호 작용을 강제하기 위해 결합 될 수있다.하여 대뇌 피질 (예 : 네인 등) 간 극성 (예 : 키네신-5 / Ase1) 강제 발전기를 도입, 우리생체 내 상황을 닮은 시작 점점 복잡 스핀들 형 구조를 재구성한다.Protocol
Representative Results
Discussion
방법은 유 중수 에멀젼 방울에 기본 유사 분열 스핀들을 재구성하기 위해 여기에 존재하는 최근의 노력을 설명했다. 기하학적 경계 내에서 스핀들 어셈블리를 공부하는 것은 많은 장점을 제공한다. 주요 피드백 메커니즘 방추사의 미세 소관 그들이 조립 된 기하학적 제한 사이에 존재한다. 미세 소관은 유사 분열 스핀들 변위가 발생할 수 있습니다 기하학적 경계로 성장할 때 힘을 밀어 생성 할 수 있습니다. 또한, 물리적 인 장벽으로 성장하면 미세 소관 재해를 유발할 수있다. 또한, 밀폐 된 형상 내의 스핀들 조립체는 차례로 직접 미세 소관 증가율 (36)에 영향을 미치는 등의 튜 불린 등의 개별 구성 요소의 점진적인 고갈을 초래할 수있다. 이들은 여기에 설명 된 분석법을 이용하여 연구 할 수 스핀들 조립체의 모든 중요한 결정 요인이다.
설명 된 분석은 작은 농도 differe에 매우 민감하다액적 성분 NCES. 이것은 작은 농도 차이가 너무 느리거나 너무 빠른 미세 소관의 성장을 초래할 수 tubulin에 대한 경우이다. 이 경우, 미세 소관 성장률들은 여전히 실험의 첫 번째 ~ 30 분 동안 온도를 조정함으로써 보정 할 수있다. 방추사 조립체 및 위치도 (피질) 힘 발생기의 농도의 변화에 매우 민감하다. 이렇게 정제 된 성분의 농도, 순도 및 활성에 의존 할 가능성이 모든 새로 정제 된 단백질을 적정 신중해야한다.
또한, 특정한 절충은 분석의 특성에 따라, 촬상 설정에서 수행 될 수있다. 먼저, 수용성 형광 튜 불린 이량 높은 수준의 화상 개별 미세 소관을 어렵게 만든다. 미세 소관은 이상 성장 수용성 튜 불린 천천히 고갈 된 바와 같이, 신호 대 잡음비가 점점 높아져 individu의 이미징을 허용알 미세 소관. 오픈 시스템 설정과는 달리 기하 구속 상당한 표백 결과, 벌크 저장소 내의 형광 분자 산소 제거제 시스템 부품의 교환을 방지한다. 특히, 시간이 지남에 따라 스핀들 어셈블리 및 위치 모니터링, 그것도 강력한 탈산 소제 시스템의 존재하에 낮은 광도를 가진 이미지에 요구된다.
이들 방법은 시험 관내 간략화 스핀들 형 구조의 상향식 재구성을 가능하게한다. 여기에 소개 된 구성 요소에 더하여, 다른 많은 요인 등 3 바이폴라 스핀들 형성, 위치, 방향, 정형을, 영향을 설명 하였다. 이 시스템은 추가의 힘 발생기의 개별 및 결합 효과를 연구하기 위해 확장 될 수있다. 이 시스템에서 현재 존재하지 않는다 스핀들 형성에 중요한 기여는 유사 분열 염색체 수 있습니다. 유사 분열 염색질은로 표시되었습니다'극성 토출 힘'(3), (2) 염색질 바인딩 RanGEF RCC1 (38)에 의해 RanGTP 구배의 형성, (3) kinetochores (해중합과 상호 작용할 수있는 소위 생성 할 수 있습니다 (1) chromokinesins에 의해 직접 스핀들 형성 ) 미세 소관 (39) 및 (4) 반대 미세 소관 (40) 사이에-기계 스프링 역할을 할 수있는 염색질 자체.
마지막으로, 기술 시스템은 현재 제한된 시간과 공간 활동을 제어 도입 힘 발전기의 국산화를 제공합니다. 세포, 많은 스핀들 어셈블리 요소는 특정 구획에 지역화 또는 제한된 시간 창에서 활성화됩니다. 현저한 예는 구체적으로는 (C)의 후방 측에 충실 네인의 활성 인 엘레 한 세포 단계의 배아는 비대칭 스핀들 포지셔닝 및 세포 분열을 촉진한다. 이 시스템에서, 우리는 현재와 같은 t을 흉내 낸의 가능성을 모색하고 있습니다광학 유전 기술에서 차용 emporal 및 비대칭 활동에 사용하는 방법. 또한, AS는 C.의 경우와 엘레 배아와 단단한 세포벽과 세포는 많은 세포 유사 분열에서 반올림하지 않습니다. 기하학적 구속 형상은 스핀들 (41)에 작용하는 힘에 기초 영향을 미칠 것이다. 따라서, 잠재적으로 정형 및 에멀젼이 기억 42,43 방울 허용 더 복잡한 마이크로 유체 시스템의 사용뿐만 아니라 비 구형 방울 스핀들 어셈블리 및 위치를 재구성하는 것이 중요 할 것이다. 마지막으로, 조직에서 세포 – 세포 및 세포 – 기질 시그널링 및 첨부들은 상피 세포에서 관찰 된 바와 같이, 스핀들 방향 지시로 번역 될 수있는 외부 신호를 제공하고, 줄기 세포. 이러한 전문적인 측면 모두이 현재 연구에서 고려되지 않은 및 유사 분열 스핀들 assemb의 생체 -like 더 reconstitutions으로 구축하는 미래의 도전을 제공 할 수 있습니다LY 및 위치.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).
Materials
| 1. Preparation of microfluidic chips | |||
| Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
| SU-8 3025 | MicroChem | ||
| Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
| Spin coater | Polos | SPIN150I | |
| PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
| 2. Microfluidic setup | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
| Glass pipets | |||
| Glass tubes | |||
| Vacuum pump | Laboport | KNF | |
| Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| Sonicator | Branson | M2800H | |
| Coverslips | 24x60mm, thickness 1.5 | ||
| Glass-slides | 26x76mm | ||
| Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
| Laboratory sealing film | Parafilm | ||
| Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
| Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
| Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
| PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
| Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
| 3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
| BSA – Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
| DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
| 4. Introducing spindle-assembly factors | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
| ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
| PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |
References
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