نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة
Summary
xenografts ورم الإنسان هي أوعية دموية وتسلل من قبل خلايا المنشأ الماوس أثناء مرحلة النمو في الجسم الحي. للالتفاف على التحيز الناجم عن هذه الخلايا تلويث خلال تحليل المصب، قمنا بتطوير طريقة السماح لاستنزاف شامل لجميع خلايا الماوس عن طريق فرز الخلايا المغناطيسي.
Abstract
وقد تم استخدام في المختبر نماذج خط الخلية لأبحاث السرطان أداة مفيدة. ومع ذلك، فقد تبين أن هذه النماذج تفشل في تقليد موثوق أورام المرضى في فحوصات مختلفة 1. تمثل xenografts ورم الإنسان معيار الذهب فيما يتعلق بيولوجية الورم، واكتشاف المخدرات، والبحث ورم خبيث 2-4. xenografts الورم يمكن استخلاصها من أنواع مختلفة من المواد مثل خطوط الخلايا السرطانية، نسيج الورم من الأورام المريض الأولية 4 أو الأورام المزروعة بشكل متسلسل. عندما نشر في الجسم الحي، وتسلل الأنسجة xenografted وأوعية دموية من خلايا المنشأ الماوس. عوامل متعددة مثل الكيان الورم، ومنشأ المواد xenografted، ومعدل النمو ومنطقة زرع تؤثر على تكوين وكمية من خلايا فأر الحالية في xenografts الورم. ومع ذلك، وحتى عندما يتم الاحتفاظ هذه العوامل ثابت، ودرجة تلوث الخلية الماوس متغيرة للغاية.
شاركntaminating خلايا فأر يضعف بشكل كبير التحليلات النهائية من xenografts الورم الإنسان. كما تظهر الخلايا الليفية الماوس كفاءات عالية الطلاء ومعدلات الانتشار، فإنها تميل إلى اكتسى الثقافات الخلايا السرطانية البشرية، خاصة البطيئة التكاثر القطعان. خلية الماوس المستمدة الحمض النووي، ومرنا، ومكونات البروتين يمكن التحيز تحليل التعبير الجيني المصب، الجيل التالي من التسلسل، وكذلك تحليل بروتيوم 5. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير طريقة سريعة وسهلة لعزل تمس الخلايا السرطانية البشرية من أنسجة الورم xenografted. ويستند هذا الإجراء على استنزاف شامل لخلايا المنشأ الماوس عن طريق الجمع بين تفكك النسيج الآلي مع dissociator الأنسجة الفوق والفرز خلية المغناطيسي. هنا، علينا أن نبرهن على الخلايا المستهدفة الإنسان يمكن أن يكون ويمكن الحصول عليها مع درجات نقاء أعلى من 96٪ في غضون أقل من 20 دقيقة مستقل عن نوع الورم.
Introduction
تتكون الأورام البشرية الصلبة الفسيولوجية متعددة فضلا عن أنواع الخلايا الورمية. وهي تشكل الأنسجة غير المتجانسة مع الهياكل البيولوجية المعقدة. العمليات البيولوجية مثل الورم تشكيل والتقدم والاستجابات نحو العلاجات ليست مفهومة تماما حتى الآن. في المختبر نماذج ثقافة الخلية تمثل أداة مفيدة لدراسة وفهم بيولوجية الورم. ومع ذلك، فإنها لا يمكن إلا أن تعكس جزئيا الهياكل والعمليات الموجودة في أنسجة الورم. قبل السريرية النماذج السرطانية البشرية موثوقة ومستقرة هي شرط أساسي لتطوير الأدوية المضادة للأورام والعلاج 4،6 فضلا عن فهم بيولوجيا الأورام، والتفاعل بين الخلايا السرطانية وبيئتهم.
نماذج ورم طعم أجنبي الإنسان المستمدة من أورام المريض الأولية تظهر العلاقات عالية في الأنسجة الأصلية فيما يتعلق بنية النسيجية، التفاعل مع الهياكل الدقيقة البيئي، وإمكانات النقيلي والاستجابة للعقاقير 7 </sup>. حتى عندما تستمد xenografts الورم من الخلايا المستنبتة أو خطوط الخلايا التي تحاكي بشكل وثيق أورام المريض، وبالتالي تبين صحة العليا في معظم المقايسات مقارنة في المختبر نماذج ثقافة الخلية. هذه الميزات تجعل منها المعيار الذهبي لنماذج ما قبل السريرية 4. وإلى جانب تطبيقها في أبحاث السرطان، كما تستخدم زرع الأعضاء من الخلايا البشرية في الفئران في كثير من الأحيان في أبحاث الخلايا الجذعية لتحديد إمكانية stemness والتمايز من السكان المستهدفين 8.
وقد تبين أن الأوعية الدموية الدقيقة البشري ويتم استبدال الخلايا المناعية الإنسان عليها في الجسم الحي انتشار الأورام البشرية 2،9. عوامل مثل النوع الفرعي الورم، ومعدل النمو، ومنطقة زرع لها تأثيرات كبيرة على المستوى العالمي من تسلل وكذلك تكوين أنواع الخلايا الماوس وجدت. ومع ذلك، وحتى عندما يتم الاحتفاظ هذه العوامل مستمر، ومقدار وتكوين خلايا فأر تتغير بصورة كبيرة.
وغالبا ما يتم الطعن التحليلات النهائية من الأنسجة xenografted من قبل خلايا المنشأ الفئران. وكثيرا ما متضخمة الثقافات الأولية للخلايا السرطانية البشرية من xenografts الليفية. إلى جانب إعاقة جيل من خطوط الخلايا السرطانية في المختبر، وتنحاز المقايسات المصب مثل المخدرات اختبار السمية الخلوية أو الدوائية منذ ذلك الحين في تصحيح سيليكون للآثار الناشئة من تلويث خلايا فأر من المستحيل في معظم الحالات. أبعد من ذلك، وعبر الحديث فقط توضيح جزئيا بين الخلايا الليفية الماوس والخلايا السرطانية البشرية له تأثير مباشر على النتائج التجريبية للدراسات 10. وعلاوة على ذلك، فإن الاختلاف الأكثر لا يمكن التنبؤ بها على نطاق واسع من تسلل خلايا فأر تفاقم التحليلات المصب الجزيئية دقيقة. في NGS أو بروتيوم يحلل كل إشارة المشتقة الماوس قياس بدلا من إشارة السرطانية البشرية يقلل مباشرة حساسية التسلسل. كما يتم الطعن ميكروأري على أساس التحليلات التعبير من خلال مجلس التوحيد الوطنى الفئرانالأحماض leic ربما عبر التهجين لتحقيقات الإنسان.
من أجل الالتفاف على العقبات تلوث خلايا فأر في التحليلات التحويلية للخلايا السرطانية البشرية قد اقترح من النماذج طعم أجنبي المناهج المختلفة. في العديد من الدراسات معزولة المطلوب الخلايا المستهدفة لتحليل المصب من خلال استخدام علامات أو مجموعات من علامات أعرب حصرا على الخلايا السرطانية البشرية. ومع ذلك، فإن عدم وجود علامات يمكن الاعتماد عليها لتحديد هوية الخلايا السرطانية البشرية في كثير من الأحيان يمثل عقبة كبيرة. علامات حتى أعرب على نطاق واسع، مثل EpCAM على سرطان الإنسان، وكثيرا ما تظهر الخلافات الورم جوهري التعبير 11. وهذا يزيد من خطر أن القطعان التعبير منخفضة، على سبيل المثال، الخلايا السرطانية خضعت-الظهارية لالوسيطة الانتقالية، والتي فقدت خلال العزلة. وبالإضافة إلى ذلك، الربط مباشرة من وكيل التحديد إلى الخلية المستهدفة قد تؤثر على نتائج التحليل لاحقة. محاولات المستنفدة خلايا فأر من قبلباستخدام مزيج من الاجسام المضادة المحددة لCD45 الفئران والطبقة الحواتم MHC أنا قدمت أيضا 12. ومع ذلك، هذا المزيج علامة فقط بالكشف عن مجموعة فرعية من خلايا فأر. وثمة نهج آخر هو تعزيز عمليات تحليل من قبل البرامج. ومع ذلك، كل هذه الطرق هي إما غير مناسبة لأي نوع من الإعداد التجريبية أو أي كيان الورم وطريقة الزرع.
في هذه الدراسة نقدم الرواية وطريقة سريعة لالمستنفدة شامل خلايا فأر من الأنسجة xenografted مستقلة من سلالة الماوس والأنسجة الأصلية. في العروض على عدة أجهزة المستهدفة وأنسجة للزرع من xenografts (بما في ذلك الجلد والرئة والدماغ والكلى والعضلات والهيكل العظمي) تمكنا من تحديد مجموعة من الأجسام المضادة السماح للكشف شامل خلايا فأر. اقترنت هذه الأجسام المضادة إلى جزيئات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic، معاير والأمثل لاستنزاف باستخدام فرز الخلايا المغناطيسي. محددة الماوس كما الوحيدوتستخدم الأجسام المضادة وخلايا المستهدفة الإنسان البقاء "لم تمس" وطريقة لا يقتصر على نسيج الورم xenotransplanted. علينا أن نبرهن على خلايا فأر إزالة شاملة من عينات الورم xenografted توحد وتسهل الثقافات الخلايا السرطانية البشرية. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن تحليل xenografts ورم الإنسان من قبل تسلسل الجيل القادم وتحسنت بشكل ملحوظ. كما لوحظ هذا التأثير على الرغم من أن مجموعة محددة التسلسل البشري قد نفذت خلال تخصيب exome، ومن المتوقع أن تكون أكثر بروزا وتأثيرا على الجينوم كله وكله Transcriptome على التسلسل. معا، وإزالة خلايا فأر باستخدام هذه الطريقة رواية تسهل زراعة الخلايا السرطانية البشرية وتحسن كبير في التحليلات النهائية من xenografts الورم الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد قمنا بتطوير طريقة سريعة وسهلة لعزل تمس الخلايا السرطانية البشرية من أنسجة الورم xenografted. ويستند هذا الإجراء على استنزاف شامل لخلايا المنشأ الماوس عن طريق الجمع بين تفكك النسيج الآلي والفرز خلية المغناطيسي. إلى جانب استنزاف جميع خلايا فأر أيضا على كمية من الخلايا الميتة والحطام وانخفاض كبير في نسبة الخلايا المستهدفة. معا، وهذه الطريقة تحسن كبير تحليلات المصب الجزيئية وزراعة الخلايا السرطانية البشرية.
وعلى النقيض من الطرق البديلة، ليست هناك حاجة لمعرفة علامات معينة الخلايا السرطانية، والتكيف مع تركيبة خلايا فأر أو إنشاء خوارزميات مختلفة. الطريقة المعروضة مستقل من سلالة الماوس ونوع الورم. ولذلك، فإن التحيز من خلال عزل القطعان السرطانية البشرية على أساس علامات محددة بشرية واحدة والتي قد تختلف في التعبير، كما هو مبين لEpCAM 11، هو تجنبأد. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يقتصر على المواد الورم ولكن يمكن استخدامها لأي نوع من الأنسجة xenotransplanted كما يتم استهداف خلايا فأر بدلا من القطعان محددة السرطانية البشرية (لا تظهر البيانات).
ومما يسهل إزالة شاملة من خلايا فأر من خلال استهداف الحواتم سطح أعرب حصرا على خلايا المنشأ الماوس. وبصرف النظر عن طريقة راسخة للتفكك الورم كما وردت في هذه الدراسة، أن هناك العديد من الإجراءات باستخدام أنواع مختلفة من الإنزيمات. الحفاظ على الحواتم سطح الخلية هو شرط مسبق لهذا الأسلوب الرواية، ولكن أيضا لإجراء تحليل دقيق للسكان الخلايا السرطانية البشرية. لذا، فمن الأهمية بمكان أن يتم استخدام الإنزيمات لطيف لهضم أنسجة الورم. وهكذا، واستنفاد الخلايا الماوس يمكن أن تستخدم إلا في تركيبة مع إجراءات عملية الهضم الأنزيمية التي من الواضح لا تؤثر الحواتم المستهدفة خلال إجراء نضوب خلايا الفأر. في حالة الشك هذه لا يمكن التحقق منها من قبل الشركة المصنعة منها.
<pالطبقة = "jove_content"> هذا الأسلوب يعمل أيضا لتعميم الخلايا السرطانية البشرية (CTCs). لكن، وكما ترددات الخلايا المستهدفة هي عادة <0.1٪ من إزالة خلايا فأر يتطلب بالإضافة إلى أحمر تحلل خلايا الدم ودرجات نقاء أكثر من 50٪ لا يمكن أن يتوقع. في هذه الحالة، واستنفاد الخلايا الماوس يمكن أن تستخدم قبل إثراء CTCs تليها تخصيب باستخدام علامات إيجابية (لا تظهر البيانات).إزالة خلايا فأر تحسن كبير في الثقافة من الخلايا السرطانية البشرية عن طريق تجنب اكتسى ثقافة الخلايا الليفية الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحسين تحليل xenografts ورم الإنسان من قبل الجيل القادم التسلسل بشكل كبير وموحدة. كما لوحظ هذا التأثير على الرغم من أن تستهدف الإنسان اختيار تسلسل معين نفذت خلال تخصيب exome، ومن المتوقع أن تكون أكثر بروزا وتأثيرا على الجينوم كله وكله Transcriptome على التسلسل.
وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة المعروضة يسهل ACCURAالدراسات الجزيئية الشركة المصرية للاتصالات من القطعان ورم داخل الأورام الإنسان xenotransplanted. إزالة خلايا فأر من عينة منها في الخطوة الأولى، وبعد ذلك فرز الخلايا السرطانية البشرية في اثنين من القطعان مختلفة تمكن المقارنة الجزيئية مباشرة للحيوانية الورم التي تهم معظم البشري الخلايا السرطانية 20. التعبير الجيني الفرق بين أنواع فرعية الخلايا السرطانية يمكن تقييم أكثر موثوقية لا يتأثر بها عبر التهجين من الجزيئات المستمدة من الماوس.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Janina Kuhl, Nadine Chelius, Petra Kussmann, Lena Willnow and Dorothee Lenhard for excellent technical assistance.
Materials
| Tumor Dissociatio Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | contains enzymes H, R and A; see data sheet for reconstitution instructions |
| RPMI 1640 | Biowest | L0501-500 | |
| gentleMACS C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| MACS SmartStrainer (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| Petri dish 100 mm | Various | ||
| Scalpel | Various | ||
| Mouse Cell Depletion Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-694 | |
| PBS | Various | use 1x PBS for PEB buffer | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3610 | use final concentration of 2 mM in PEB buffer |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | or use 5 mg/L BSA in PEB buffer |
| MACS LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| PreSep filters (70 µm) | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| CD326-FITC, human | Miltenyi Biotec | 130-080-301 | use 1:40 for immunofluorescence staining |
| anti-Vimentin antibody | abcam | ab92547 | |
| goat-anti-mouse IgG-Alexa488 | Life Technologies | A11029 | |
| goat-anti-rabbit IgG-Alexa594 | Life Technologies | A11012 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | dilute to a final concentration of 0.1 µg/ml in 0.1 M sodium bicarbonate |
| Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | InsideFix from this kit can be used for fixation step during immunofluorescence staining |
| FBS | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93418 | |
| FcR Blocking Reagent, mouse | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2500-100g | |
| Nextera Rapid Capture Enrichment Kit | Illumina | FC-140-1000 | |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
References
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494 (2013).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
- Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
- Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
- Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
- Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
- Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
- Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. . Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , (2014).
- Agorku, D., et al. . Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , (2015).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146 (2015).
