İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu
Summary
İnsan kalp dokusu miyokardiyal rejenerasyonu için uygun multipotent perivasküler öncü hücre popülasyonlarının barındırır. Perisitler ve CD34 + CD146 – – adventisya hücreleri, insan miyokard burada tarif edilen teknik, yerli kan damarları, örneğin CD146 + CD34 ile ilgili iki multipotent stromal hücre popülasyonlarının eş zamanlı izolasyonu ve saflaştırılması mümkün kılar.
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
Kalp uzun bir post-mitotik organı olarak kabul edilmiştir. Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar, yetişkin insan kalbinde 1 sınırlı kardiyomiyosit devir varlığını göstermiştir. Kardiyomiyosit farklılaşma potansiyeline sahip yerli kök / progenitör hücreleri de perivasküler öncü hücreleri 2,3, en son yetişkin kemirgen ve Sca-1 + dahil olmak üzere insan kalpleri, c-kit +, cardiosphere oluşturan miyokardın içinde tespit ve oylandı. Bu hücreler, hücre transplantasyonu veya in-situ çoğalmasının uyarımı yoluyla kalp onanmı / rejenerasyonunu arttırmaya yönelik terapiler için ilgi çekici adaylardır.
Mezenşimal kök / stromal hücreler (MSC), kardiyovasküler tamir 6 olarak MSC terapötik uygulamalarının 4,5 klinik çalışmalar çok patolojik durum için yapılmıştır, hemen hemen her insan dokusundan izole edilmiştir, graft-versus-host-hastalığını 7 </sup> Ve karaciğer sirozu 8. Yararlı etkileri için MKH yeteneği atfedilen: inflamasyon 9 sitelere ev; farklı hücre tipleri 10 içine ayırt; yanlısı onarıcı molekülleri 11 salgılarlar; ve konak immün yanıtları 12 modüle. MKH izolasyonu geleneksel plastik yüzeylere kendi tercihli bağlılık güvendi. Bununla birlikte, hücrelerin elde edilen popülasyon, tipik olarak 13 belirgin da çok düşüktür. Anahtar perivasküler hücre belirteçleri bir kombinasyonu ile (FACS) floresan aktive hücre kullanarak, multipotent MSC gibi ön-madde popülasyonu (- / CD34 – / CD45 – / – CD56 CD146 + / CD31) izole edilmesi ve saflaştırılması mümkün olmuştur yetişkin iskelet kası ve beyaz yağ 14 dahil olmak üzere birden insan dokuları.
Çeşitli kalp dışı dokularda perivasküler hücre popülasyonlarının kök / progenitör hücre özelliklerini bir olması gösterilmiştirnd kardiyovasküler ortamda klinik kullanım için araştırılmaktadır. Perisitler, en iyi bilinen perivasküler hücre alt biri, yeni damarların 15 gelişiminde dahil olmak üzere birçok patofizyolojik roller oynayabilir heterojen nüfus vardır, kan basıncı 16, ve damar bütünlüğü 17,18 bakım düzenlenmesi. Çoklu dokularda gösterildiği gibi, perisitlerin spesifik alt özgün MSC antijenleri ifade ve FACS saflaştırma 14 sonra birincil kültürdeki MSC benzeri fenotipleri sürdürmek. Ayrıca, bu hücreler, kararlı bir şekilde kültür içinde uzun vadeli fenotipleri korumak ve MSC 19,20 benzer çok-dizi farklılaşma potansiyel sergilerler. Bu sonuçlar perisitler zor MSC 14 kökeni biri olduğunu düşündürmektedir. perisitlerin terapötik potansiyeli, miyokardiyal yara bir azalma ile gösterilmiş ve işemik yaralı transplantasyon ardından kalp fonksiyonunun geliştirilmiştirkalpleri 21. Son zamanlarda, başarılı insan miyokartdan perisitleri saflaştırılmış ve iskelet Miyogenesis 3 yokluğu ile onların MSC gibi fenotipleri ve multipotency (adipogenesis kondrogenezis ve osteogenezis) gösterdi. Buna ek olarak, miyokard perisitler diğer organlarda arınmış meslektaşları ile karşılaştırıldığında farklı cardiomyogenic potansiyeli ve anjiyogenik kapasitelerini sergiledi.
Multipotent perivasküler kök / progenitör hücrelerin, adventisyal hücrenin ikinci bir nüfus, pozitif CD34 ifade 22 temelinde insan safen damarlar izole edilmiştir. Venöz adventisya hücrelerinin klonojenik potansiyel mezodermal farklılaşma kapasitesi ve in vitro proanjiyojenik potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. Farelerin işemik yaralı kalplerine bu hücrelerin nakli geçiş fibrozu bir azalma, anjiyojenez ve miyokardiyal kan akışında bir artış, azalan ventriküler dil ile sonuçlanmıştıration ve artmış kardiyak ejeksiyon fraksiyonu 23. İlginç bir şekilde, adipoz adventisya hücrelerinin stimülasyon 24 ile perisit fenotip kabul öne CD34 ekspresyonunu vermek ve Anjiyopoietin II tedaviye yanıt olarak kültür CD146 ekspresyonunu yukarı regüle ettiği gösterilmiştir. kalp içinde, ancak, adventisya hücre popülasyonu arasından ileriye FACS ve / veya iyi karakterize ile saflaştırılmıştır edilmemiştir. Aşağıdaki bölümlerde açıklanan hücre izolasyon prosedürleri kullanarak, şu anda miyokard adventisyal hücreler karakterize ve rejeneratif uygulamalar için kendi potansiyelini araştırıyor.
Bu yazıda izole ve insan fetal veya yetişkin miyokartdan perivasküler kök / progenitör hücrelerin iki alt popülasyonlar arındırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu prospektif hücre izolasyon yöntemi karşılaştırmalı çalışmalar ve furthe için insan kalbi biyopsilerinden izogenik perivasküler kök / progenitör hücre alt grupları elde etmek için araştırmacılar sağlayacakr çeşitli kardiyak patolojik durumlarda terapötik potansiyelini keşfetmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Artan kanıtlar yaralanma sonrası yetişkin insan kalbinin sınırlı rejeneratif kapasitesi destekler. Yaralı kalplerinde böyle rejeneratif yanıtları sorumlu yerli öncü hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ilgili mekanizmalar ve sinyal yollarının anlaşılması ve terapötik bu hücreleri kullanmak için yaklaşımların geliştirilmesi hem de kritik öneme sahiptir.
Önceki protokoller insan iskelet kası 25 den perivasküler öncü hücre alt gruplarının iz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
- Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
- Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
- Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
- Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
- Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
- Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
- Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
- Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
- Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
- Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
- Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
- Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
- Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
- Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
- Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
