בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב
Summary
ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 + CD34 – pericytes ו CD34 + CD146 – תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
הלב מזה זמן רב נחשב איבר שלאחר mitotic. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מחזור cardiomyocyte מוגבל בלבות בני האדם המבוגר 1. תאי גזע / אב Native עם פוטנציאל התמיינות cardiomyocyte גם זוהו בתוך שריר הלב ב מכרסמים מבוגרים בליבותיהם, כולל SCA-1 +, c-kit +, cardiosphere יוצרים, ולאחרונה, 2,3 תאי מבשר perivascular. תאים אלה מייצגים מועמדים אטרקטיביים עבור טיפולים שמטרתם הגברת תיקון / התחדשות לב באמצעות השתלה תאית או גירוי של התפשטות in-situ.
גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) בודדו כמעט מכל רקמה אנושית 4,5 ניסויים קליניים של היישומים הרפואיים של MSC בוצעו עבור במצבים פתולוגיים רבים כגון תיקון לב וכלי דם 6, שתל נגד מאכסן מחלה 7 </sup>, וכבד שחם 8. השפעות מועילות יוחסו היכולת של MSCs ל: בית לאתרים של דלקת 9; להתמיין לסוגי תאים שונים 10; להפריש מולקולות פרו-מתקן 11; ולווסת תגובות מארח חיסון 12. בידודו של MSCs הסתמך באופן מסורתי על הדבקות המועדפת שלהם מצעי פלסטיק. עם זאת, האוכלוסייה של תאים והתוצאה היא בדרך כלל במידה ניכרת הטרוגניים 13. באמצעות תא פלורסנט מיון מופעל (FACS) עם שילוב של סמני תא מפתח perivascular, הצלחנו לבודד ולטהר אוכלוסייה מבשרת MSC הדמוי מולטיפוטנטיים (CD146 + / CD31 – / CD34 – / CD45 – / CD56 -) מ ברקמות אנושיות מספר כולל שרירי שלד מבוגרים ו -14 שומן לבן.
אוכלוסיות תאי perivascular ברקמות שאינן לב שונות הוכחו כבעלי תכונות של תאי גזע / אבnd נחקרים לשימוש קליני הגדרת הלב וכלי הדם. Pericytes, אחד תת תא perivascular הידוע ביותר, הם אוכלוסייה הטרוגנית ממלאות תפקידי pathophysiological מספר כולל בפיתוח הכלי החדש 15, ויסות לחץ דם 16, ותחזוקה של שלמות כלי דם 17,18. כפי שניתן לראות רקמות מרובות, תת-מערכות ספציפיות של pericytes המקורי להביע אנטיגנים MSC ולקיים פנוטיפים MSC הדמוי שלהם בתרבות העיקרית לאחר FACS טיהור 14. יתר על כן, תאים אלה ביציבות לשמור פנוטיפים שלהם לטווח הארוך בתוך התרבות להפגין פוטנציאל התמיינות רבה שושלת, בדומה MSCs 19,20. התוצאות מראות כי pericytes הוא אחד המקורות של MSC החמקמק 14. הפוטנציאל הטיפולי של pericytes הודגם עם ירידת הצטלקות שריר לב ומשופר תפקוד לב לאחר השתלה לתוך ischemically נפצעלבבות 21. לאחרונה, אנו מטוהרים בהצלחה pericytes מן שריר הלב האנושי והפגינו MSC דמוי פנוטיפים ו multipotency (adipogenesis, chondrogenesis ו osteogenesis) שלהם עם העדר myogenesis השלד 3. בנוסף, pericytes שריר הלב הציג יכולות פוטנציאליות ו angiogenic cardiomyogenic ההפרש בהשוואה לעמיתיהם מטוהרים מאיברים אחרים.
אוכלוסייה שנייה של ובתאים / גזע perivascular מולטיפוטנטיים, תא adventitial, מבודדת מייתר ורידי אדם saphenous על בסיס ביטוי CD34 החיובי 22. תאי adventitial ורידים הוכחו כבעלי פוטנציאל clonogenic, קיבולת בידול mesodermal ופוטנציאל proangiogenic במבחנה. השתלה של תאים אלה לתוך ליבם נפגע ischemically של עכברים הביא לירידה ב סיסטיק ביניים, גידול אנגיוגנזה זרימת הדם בשריר הלב, מופחת חדרית dilation, פליטת לב מוגברת חלק 23. מעניין לציין, כי תאי adventitial שומן הוכחו לאבד ביטוי CD34 ו upregulate ביטוי CD146 בתרבות בתגובה לטיפול angiopoietin השני, דבר המצביע על אימוץ פנוטיפ pericyte עם גירוי 24. בתוך הלב, לעומת זאת, אוכלוסיית תא adventitial טרם מטוהרת באופן פרוספקטיבי על ידי FACS ו / או גם מאופיין. ניצול הליכי בידוד תא המתוארות בסעיפים הבאים, אנו נמצאים כעת מאפיינת תאי adventitial שריר לב לחקור את הפוטנציאל שלהם ליישומים רגנרטיבית.
בזאת אנו מתארים שיטה לבודדת ולטהר שתי תת-אוכלוסיות של תאי גזע / אב perivascular מ שריר לב עוברי או אדם בוגר. שיטה פוטנציאלית לצינוק זה תאפשר לחוקרים לקבל גזע perivascular isogenic / אב תת תא ביופסיות לב אנושיות ללימודים השוואתיים further לחקור הפוטנציאל הטיפולי שלהם שונים במצבים פתולוגיים הלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
ראיות הגדלת תומך יכולת התחדשות מוגבלת של הלב האנושי המבוגר לאחר פציעה. זיהוי ואפיון של תאי מבשר יליד אחראים תגובות התחדשות כאלה לבבות פגועים הם קריטיים עבור שני להבנת מנגנונים הקשורים מסלולי איתות ופיתוח הגישות לנצל תאים אלה טיפוליים.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;dir…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
- Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
- Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
- Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
- Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
- Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
- Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
- Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
- Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
- Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
- Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
- Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
- Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
- Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
- Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
- Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
