عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة
Summary
الأنسجة القلبية الإنسان تؤوي متعددة القدرات ماحول الأوعية السكان الخلية السلائف التي قد تكون مناسبة لتجديد عضلة القلب. تقنية الموضحة هنا يسمح للعزلة في وقت واحد وتنقية اثنين متعددة القدرات سكان الخلية انسجة المرتبطة السفن الأم الدم، أي CD146 + CD34 – pericytes وCD34 + CD146 – خلايا الغلالة البرانية، من عضلة القلب البشري.
Abstract
Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34– pericytes and vascular CD34+CD146– adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.
Introduction
وقد اعتبر قلب لفترة طويلة جهاز بعد الإنقسامية. ومع ذلك، فقد أثبتت الدراسات الحديثة وجود دوران cardiomyocyte محدود في قلوب البشر الكبار 1. كما تم تحديد الأم الخلايا الجذعية / السلف مع cardiomyocyte التمايز المحتملة داخل عضلة القلب في القوارض الكبار وقلوب البشر، بما في ذلك هيئة السلع التموينية-1 +، ج طقم +، cardiosphere تشكيل، وكان آخرها، وخلايا السلائف المحيطة بالأوعية 2،3. وتمثل هذه الخلايا المرشحين جذابا للالعلاجات التي تهدف إلى تعزيز القلب إصلاح / تجديد من خلال زرع الخلايا أو التحفيز من الانتشار في الموقع.
وقد تم عزل الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة (MSC) من كل الأنسجة البشرية تقريبا أجريت 4،5 التجارب السريرية من التطبيقات العلاجية للجنة السلامة البحرية خارج عن الحالات المرضية متعددة مثل إصلاح القلب والأوعية الدموية 6، الطعم ضد المضيف المرض 7 </sup>، وتليف الكبد 8. وقد نسبت آثار مفيدة لقدرة اللجان الدائمة ل: منزل لمواقع التهاب 9؛ التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا 10؛ تفرز جزيئات الموالية للتعويضية 11؛ وتعدل المضيف الاستجابات المناعية 12. عزل اللجان الدائمة وتعتمد تقليديا على الالتزام تفضيلية لركائز بلاستيكية. ومع ذلك، فإن السكان الناتجة من الخلايا عادة غير متجانسة بشكل ملحوظ (13). باستخدام الفلورسنت خلية تنشيط الفرز (FACS) مع مجموعة من العلامات الرئيسية الخلايا المحيطة بالأوعية، وكنا قادرين على عزل وتنقية تشبه MSC متعددة القدرات السلائف السكان (CD146 + / CD31 – / CD34 – / CD45 – / CD56 -) من الأنسجة البشرية متعددة بما في ذلك الكبار العضلات والهيكل العظمي والأبيض الدهون 14.
وقد تبين أن أعداد الخلايا المحيطة بالأوعية في مختلف الأنسجة غير القلب أن لها خصائص الجذعية / خلية سلفية لالثانية يجري التحقيق للاستخدام السريري في الإعداد القلب والأوعية الدموية. Pericytes، واحدة من مجموعات فرعية الخلايا المحيطة بالأوعية الأكثر شهرة، هي مجموعة متغايرة التي تلعب العديد من الأدوار المرضية بما في ذلك تطوير السفن الجديدة 15، وتنظيم ضغط الدم 16، والحفاظ على سلامة الأوعية الدموية 17،18. كما هو مبين في أنسجة متعددة، مجموعات فرعية محددة من pericytes التعبير أصلا المستضدات لجنة السلامة البحرية والحفاظ الظواهر مثل لجنة السلامة البحرية في الثقافة الابتدائية بعد تنقية FACS 14. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا مستقر الحفاظ على الظواهر على المدى الطويل في الثقافة ويحمل متعددة النسب إمكانية التمايز، على غرار اللجان الدائمة 19،20. وتشير هذه النتائج إلى أن pericytes هي واحدة من أصل MSC بعيد المنال 14. وقد تجلى الإمكانات العلاجية من pericytes مع انخفاض في تندب عضلة القلب وتعزيز وظيفة القلب بعد زرع إلى إصابة ischemicallyقلوب 21. في الآونة الأخيرة، ونحن تنقيته بنجاح pericytes من عضلة القلب البشري وأظهرت الظواهر الخاصة مثل لجنة السلامة البحرية وmultipotency (تكون الشحم، تكون الغضروف وتكون العظم) مع غياب تكون العضل الهيكل العظمي 3. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت pericytes عضلة القلب فارق القدرات المحتملة وعائية cardiomyogenic بالمقارنة مع نظرائهم تنقيته من الأجهزة الأخرى.
عدد سكانها الثاني من الخلايا المحيطة بالأوعية متعددة القدرات الجذعية / السلف، الخلية الغلالة البرانية، تم عزل من الأوردة الصافن الإنسان على أساس CD34 إيجابي التعبير 22. وقد تبين أن خلايا الغلالة البرانية الوريدية لديها إمكانات مولد الرمع، والقدرة على التمايز أرومية متوسطة وإمكانات proangiogenic في المختبر. أدى زرع هذه الخلايا في قلوب الجرحى ischemically من الفئران في الحد من التليف الخلالي، وزيادة في الأوعية الدموية وتدفق الدم عضلة القلب، وانخفاض البطين ديلأوجه، وزيادة طرد القلب جزء 23. ومن المثير للاهتمام، وقد ثبت أن الخلايا الدهنية الغلالة البرانية لانقاص التعبير CD34 وupregulate التعبير CD146 في الثقافة في الاستجابة للعلاج angiopoietin الثاني، مما يشير إلى اعتماد النمط الظاهري خلية حوطية مع التحفيز 24. داخل القلب، ومع ذلك، فإن سكان الخلية البرانية لم يتم تنقيته مستقبلي من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية و / أو تتميز بشكل جيد. الاستفادة من إجراءات العزل خلية وصفها في الأقسام التالية، نحن تميز حاليا خلايا عضلة القلب الغلالة البرانية والتحقيق في قدرتها على التجدد التطبيقات.
هنا نحن تصف طريقة لعزل وتنقية اثنين من القطعان من الخلايا الجذعية / السلف المحيطة بالأوعية من البشر عضلة القلب الجنين أو الكبار. وهذا المحتملين طريقة العزلة خلية تمكين الباحثين من الحصول على إسوي المحيطة بالأوعية مجموعات فرعية من الخلايا الجذعية / السلف من الخزعات قلب الإنسان للدراسات المقارنة وابعد من ذلكص استكشاف الإمكانات العلاجية في مختلف الحالات المرضية القلبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
أدلة متزايدة تدعم القدرة على التجدد محدودة من قلب الإنسان الكبار بعد تعافيه من الاصابة. تحديد وتوصيف الخلايا الطليعية الأم مسؤولة عن مثل هذه الردود التجدد في قلوب المصابة حاسمة لكلا فهم الآليات المرتبطة بها ومسارات إشارات ووضع نهج للاستفادة من هذه الخلايا علاجيا. </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).
Materials
| AbC Anti-mouse Bead Kit | Molecular Probes | A-10344 | |
| Collagenase I | Gibco | 17100-017 | Reconstitute powder as required and filter sterilise |
| Collagenase II | Gibco | 17101-015 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| anti-human CD34-PE | BD Pharmingen | 555822 | Keep sterile |
| anti-human CD45-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Keep sterile |
| anti-human CD56-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Keep sterile |
| anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| anti-human CD146-AF647 | AbD Serotec | MCA2141A647 | Keep sterile |
| EGM2-BulletKit | Lonza | CC-3162 | For collection of cells and culture until adhered |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | ThermoFischer Scientific | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFischer Scientific | 10500-064 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Dilute with sterile water |
| IgG1k-PE | BD Pharmingen | 559320 | Keep sterile |
| IgG1k-APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557873 | Keep sterile |
| IgG1k-PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557872 | Keep sterile |
| IgG1k-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 561566 | Keep sterile |
| IgG1k-647 | AbD Serotec | MCA1209A647 | Keep sterile |
| Mouse serum | Sigma Aldrich | M5905 | Keep sterile |
| Paraffin Film – Parafilm M | Sigma Aldrich | P7793 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15979-063 | Freeze in aliquots and keep sterile |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 | ThermoFischer Scientific | 10010-023 | Keep sterile |
| Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max | Sigma Aldrich | R7757 | Keep sterile |
| Trypan Blue Solution | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Trypsin-EDTA 0.5%(10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| FACSARIA FUSION | BD Pharmingen | Fluorescence Activated Cell Sorter |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
- Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
- Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
- Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
- Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
- Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
- Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
- Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
- Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
- Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
- Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
- Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
- Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
- Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
- Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
- Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
- Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
- Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
- Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).
