Analys av Brain Mitokondrier Använda Serial Block-Face Svepelektronmikroskopi

Mitokondrier är dynamiska organ som ändrar sin form och placering beroende på de cellulära signaler och behov, i tät samverkan med cell cytoskelettet, och som svar på cellulära händelser såsom kalciumströmmar i nervceller ^1. Mitokondrier också interagera med andra cellulära organeller t.ex. endoplasmatiska retiklet, vilket i sin tur reglerar deras dynamik och metabolism ^2. Mitokondriell morfologi visar heterogenitet i olika celltyper dvs. formen av organell varierar från rund som består av lakan, säckar och ovaler ^3. Det har visat sig att mitokondriella fusion och fission cykelproteiner kan reglera läge, storlek, form och fördelning av mitokondrier ^4. Dessutom är förändringar i mitokondriell form i samband med neurodegeneration, neuronal plasticitet, muskelatrofi, kalciumsignalering, reaktiva syreradikaler generation samt livslängd och celldöd blandar thaT-cellspecifika mitokondriell morfologi är avgörande för att upprätthålla normal cellfunktion ^5-11.

En stor bioenergetisk funktion av mitokondrier är att generera adenosintrifosfat (ATP) genom att exekvera en serie av metaboliska reaktioner som involverar fullständig nedbrytning av näringsämnen (dvs. glukos, fett-syror eller aminosyror) via TCA-cykeln och OXPHOS Pathways ^12. Den mänskliga hjärnan utgör endast 2% av kroppsvikten men det förbrukar ~ 20% av den totala energi som produceras vilket gör det extremt energikrävande organ ^13. Det är därför inte förvånande att mitokondriell dysfunktion hos människor leder till ett stort antal neurologiska manifestationer ^14-17. Genetiska mutationer i OXPHOS komponenter som försämrar ATP generation leder till mitokondriella sjukdomar ^17,18, som är kliniskt heterogen grupp av sjukdomar med en prevalens på ~ 1: 5000 personer, och en av de vanligaste orsaken till metabolic störningar hos barn och vuxna. Underskott på mitokondrierna härrörande ATP påverkar flera organsystem med hög energikrävande organ såsom hjärna, hjärta och skelettmuskler som främst berörs i dessa patienter ^14,17,18. Under de senaste åren har flera studier visade för mitokondriell dysfunktion hos både nervsystemets och neurodegenerativa sjukdomar ^15-17,19,20. Eftersom mitokondrierna är viktigt och avgörande för hjärnans utveckling och funktion, är det absolut nödvändigt att utveckla protokoll som kan analysera förändringar i hjärnans mitokondriell morfologi, struktur, storlek, antal och fördelning under både friska och sjuka tillstånd. Musmodeller med mitokondriellt riktade grönt fluorescerande protein (GFP) har tagits fram för att visualisera mitokondriella rörelser och lokalisering i hjärnan ^21,22. Även om detta är ett mycket användbart verktyg för att undersöka mitokondriell rörlighet och allmän spridning, det finns vissa nackdelar som inkludee begränsad upplösning och känslighet fluorescensmikroskopi. Dessa attribut gör det svårt att spåra de relativt liten storlek mitokondrier. På liknande sätt har seriell transmissionselektronmikroskopi med framgång använts för att visa synaptisk mitokondrier ^23, men denna metod är mycket tidskrävande. Mitochondrial morfologi är känd för att vara mycket dynamisk som de genomgår kontinuerliga klyvnings och fusionscykler, och i de flesta celler mitokondrier upprätthålla ett starkt sammanhängande nätverk ^24-26. Nervceller är mycket polariserade celler med flera dendriter och utökade axoner, och mitokondrier som bildar en ansluten retikulära nätverket i cellkroppen kan behöva separera när de gör sig igenom dessa neuriter (Figur 1). Detta gör hjärnmitokondrier extremt varierande i storlek och form. Exempelvis med användning av serieblock-face svepelektronmikroskopi (SBFSEM) teknik, som tidigare observerade vi att skillnaden i volymen eller storleken av extrasynaptic mitochondrIA till mitokondrierna som finns i nervändarna kan vara så mycket som sexton vika ^27.

Det finns flera metoder för att utföra volym analyser ^28, som innefattar serie avsnitt TEM ^29, automatiserad tejp samla ultramicrotome SEM ^30, fokuserad jonstråle SEM ³¹ och SBFSEM ^32. Den SBFSEM analys har fördelar i att den har upplösningen för att ge kvantitativa uppgifter om den morfologiska form, storlek, fördelning och antal organeller såsom mitokondrier i områden upp till 1 mm i hjärnan. Den tekniska driften är också minst krävande, med datainsamling och analys inom kapacitet många biologiska laboratorier som saknar tidigare EM erfarenhet. Tillkomsten av kommersiella instrument för att generera seriesektionsliknande bilder har gjort 3D ultra analys av vävnader en rutinteknik, vilket ytterligare tillåter en opartisk volymetriska analyser på ett snabbt och repeterbart sätt ²⁸ </sup>. Den SBFSEM beskrevs först och används inom neurobiologi 2004 ^32, baserat på en idé som infördes genom Leighton i 1981 ^33. Flera studier har sedan dess etablerat denna teknik som ett viktigt verktyg i återuppbyggnaden analys av neuronala kretsar ^34. Dessutom för många mindre projekt, ger det återuppbyggnads analys för att identifiera cellulära organeller ^27,35-39. Eftersom de förvärvade bilderna härrör från lågspänning tillbaka scatter elektroner har nya färgningsprotokoll som kombinerar olika kända tungmetallfärgningstekniker utvecklats för att öka upplösningen ^40.

I detta dokument ger vi ett protokoll för att utnyttja 3D-elektronmikroskopi avbildning och volymetriska analys av hjärn mitokondrier baserat på metoder som tidigare har använts av oss och andra ^38,39,41. De vävnads post-bearbetningsmetoder som användes var såsom beskrivits tidigare av Deerinck et al40.