によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用<em> Q熱リケッチア</em>のsiRNAサイレンシング中

Q熱リケッチアは人獣共通ヒト感染のQ熱の原因となるユニークな細胞内病原体です。この疾患は、多くの場合、暴露¹の後に心内膜炎の年として現れる生命を脅かす慢性感染症に無症候性抗体陽転から延びる臨床症状の広いスペクトルに関連しています。ヒトへの感染は、反芻動物感染症、特に、乳牛、羊やヤギのための主要なリザーバと、主に汚染されたエアロゾルの吸入を介して行われます。これらの動物におけるコクシエラ感染は通常、無症候性であるが、感染は流産を引き起こす可能性と出産流体と胎盤内のかなりの細菌負荷は、ローカル環境^1を汚染することができます。このような汚染が公衆衛生と農業産業の両方に持つことができる巨大な負担の例は、最近オランダ²で発生したQ熱の流行で観察されました。 2007との間2010年には、Q熱の4,000以上のヒト症例が診断され、この流行はヤギ農場³の重大な汚染に連結されていました。さらに、 コクシエラは厳しい罹患率と死亡率^4を引き起こす細菌や必要な低感染量の環境安定性に米国疾病対策予防センター、によって分類され、潜在的な生物兵器です。

コクシエラは、2つの段階に存在する：天然源から単離されたフェーズIの生物は、非常に病原性であり、フェーズIIの生物は非常に生体内で減衰されます。例えば、 コクシエラバーネッティナインマイルフェーズIの生物のいくつかのin vitroで継代した後、フェーズII細菌は切り捨てリポポリサッカライド^（LPS）5で得られた不可逆的な染色体欠失を含有する製造されました。この株、C.バーネッティ NMIIは、組織培養モデルにおけるI相に表現型が類似しており、安全なモードを提供します研究室⁵にコクシエラの病因を研究する研究者のためのリットル。近年では、いくつかのブレークスルーは急速にコクシエラの遺伝学の分野を進めてきました。最も顕著なのは、純粋メディア（酸性クエン酸、システイン媒体- ACCM-2）の開発は、液体と^6,7固形培地上の両方でコクシエラの無細胞成長を可能にしました。これは、誘導性遺伝子発現システム、シャトルベクターとランダムトランスポゾンシステムを^8月11日を含むコクシエラために利用可能な遺伝子ツールの直接的な改善をもたらしました。最近では、標的遺伝子の不活性化のための2つの方法は、特定の病原性遺伝子の候補^12を検査するための道を切り開いて、開発されてきました。

肺胞マクロファージによる内在続いて、 コクシエラは膜結合区画内に高い数字に複製は液胞（CCV）を含むCoxiella-と呼ばれます。 CCVは、エンドサイトーシス人身売買番目のホストが必要ですラフ初期および後期エンドソームはリソソーム由来の細胞小器官¹³内に成熟するまで。このプロセスを通じて、CCVは、どちらかが一過現れるかを含め、液胞に関連付けられているが、Rab5の、Rab7、CD63およびLAMP-1 ^13-15、これらに限定されないままと宿主因子を取得します。宿主細胞内でコクシエラのレプリケーションが完全に機能するドット/ ICMタイプIVB分泌系^{（T4SS）8,16,17}に完全に依存しています。この分泌系はancestrally共役システムに関する多タンパク質構造であり、細菌タンパク質を送達するために、両方の細菌および液胞の膜にまたがる、宿主細胞質¹⁸に、エフェクターと呼びます。 コクシエラ T4SSは、機能的には十分に特徴付けタイプレジオネラニューモ ^19,20のIVBドット/ ICM分泌系に非常に類似しています。 コクシエラが酸性リソソーム由来に達するまで興味深いことに、T4SSとその後のエフェクター転座の活性化は発生しませんオルガネラ、約8時間の感染後^17,21。現在までに、130以上のドット/ ICMのエフェクターは^{9,17,22-24を}同定されています。これらのエフェクターの多くは、おそらく宿主細胞内コクシエラの複製中に重要な役割を果たしています。しかし、わずか数エフェクターは機能的に^25-29を特徴づけられています。

本研究では、宿主細胞の細胞質（ 図1）内のβラクタマーゼ活性を介して（以下BLAM基板と呼ぶ）CCF2-AM FRET基質の切断に依存する蛍光に基づく転位アッセイを利用します。目的の遺伝子は、構成的発現を提供するレポータープラスミドのTEM-1βラクタマーゼ（BLAM）に融合されます。 BLAM基質はFRET対を形成する2つのフルオロフォア（クマリンおよびフルオレセイン）で構成されています。フルオレセインおよびエフェクター転座の不在下で緑色の蛍光発光のFRETのクマリン結果の励起;しかし、Blaの場合M-エフェクター融合タンパク質が宿主細胞質に転位され、得られたβラクタマーゼ活性切断励起以下の青色蛍光発光を生成するFRETペアを分離BLAM基板のβラクタム環、。この転座アッセイはよくC.含むさまざまな細胞内および細胞外の細菌の範囲からエフェクタータンパク質を同定するためのアプローチとして実証されていますバーネッティ 、L.ニューモ 、L. longbeachae、 トラコーマクラミジア 、腸管病原性E.大腸菌 、 サルモネラ菌およびブルセラ ^17,30-35。

コクシエラエフェクター転上の特定の宿主因子の役割を決定するために、我々は、特定の低分子干渉RNA（siRNA）で、RNA干渉として知られている遺伝子サイレンシングのための十分に確立された方法を利用します。もともと線虫（Caenorhabditis elegans）で同定され、RNA干渉は、先天性defeに使用保存された内因性細胞プロセスであり、ウイルスだけでなく、遺伝子調節^36,37に対してNSE。配列特異的なsiRNAの結合後、mRNAの分解は、特異的な遺伝子サイレンシングまたはノックダウン³⁸で得られた（RNA誘導サイレンシング複合体）RISCを介して行われます。この研究では、siRNAは、エンドサイトーシス経路の重要な調節因子である2つのホストタンパク質、Rab5AとRab7Aを標的化するために使用しました。エフェクター転上Rab5AとRab7Aサイレンシングの影響は、Cを使用して確認しましたバーネッティ pBlaM-CBU0077。それは以前にコクシエラ ¹⁷のドット/ ICMの分泌系によって転位することが示されたようCBU0077を選択しました。

siRNAの遺伝子サイレンシング、ここでは説明fluorescencebased転座アッセイの両方を利用して、我々はコクシエラによってエフェクタータンパク質の転位に宿主因子の役割を確立するために始めています。このアプローチは、類似secretioを有し、両方の細胞内および細胞外の細菌の広い範囲に適用することができますエフェクタータンパク質のトランスロケーションを担当するN個のシステム。