Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em> Burnetii Coxiella</em> Durante siRNA Silencing

Coxiella burnetii è un patogeno intracellulare unico che provoca la febbre Q infezione umana zoonotici. Questa malattia è associata con un ampio spettro di manifestazioni cliniche che si estendono dalla sieroconversione asintomatica a infezione cronica pericolosa per la vita, che spesso si manifesta come anni endocardite dopo l'esposizione ^1. L'infezione umana avviene principalmente attraverso l'inalazione di aerosol contaminati con ruminanti il ​​principale serbatoio di infezione, in particolare, vacche da latte, pecore e capre. Anche se l'infezione Coxiella in questi animali è in genere subclinica, l'infezione può innescare l'aborto e la notevole carica batterica all'interno del fluido parto e la placenta può contaminare l'ambiente locale ^1. Un esempio di enorme peso tale contaminazione può avere sia la salute pubblica e il settore agricolo è stato recentemente osservato nel focolaio febbre Q che si è verificato nei Paesi Bassi ^2. Tra il 2007 eIl 2010, oltre 4.000 casi umani di febbre Q sono stati diagnosticati e questa epidemia era legata alla contaminazione significativa delle aziende agricole di capra ^3. Inoltre, Coxiella è un potenziale arma biologica, come classificati dai Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie, a causa della stabilità ambientale dei batteri e bassa dose infettante necessaria per causare grave morbilità e mortalità ^4.

Coxiella esiste in due fasi: Fase I microrganismi, isolati da fonti naturali, sono estremamente virulenti e organismi di fase II sono molto attenuate in vivo. Ad esempio, dopo diversi passaggi in vitro degli organismi Coxiella burnetii Nine Mile Fase I, Fase II, i batteri sono stati prodotti che contengono una delezione cromosomica irreversibile conseguente lipopolisaccaride tronco (LPS) ^5. Questo ceppo, C. burnetii NMII, è fenotipicamente simile alla Fase I in modelli di coltura di tessuti e fornisce una modalità più sicural per i ricercatori di studiare Coxiella patogenesi nei laboratori ^5. Negli ultimi anni molti passi avanti sono rapidamente avanzato il campo della genetica Coxiella. Più in particolare, lo sviluppo dei mezzi di comunicazione axeniche (acidificato medio cisteina citrato – ACCM-2) ha permesso la crescita privo di cellule di Coxiella sia liquido e su supporti solidi ^6,7. Ciò ha determinato miglioramenti diretti di strumenti genetici disponibili per Coxiella tra cui un sistema di espressione del gene inducibile, vettori navetta e sistemi di trasposoni casuali ^8-11. Più di recente, sono stati sviluppati due metodi per l'inattivazione genica mirata, aprendo la strada per l'esame specifico di virulenza geni candidati ^12.

A seguito di interiorizzazione da parte dei macrofagi alveolari, Coxiella replica ai numeri elevati all'interno di un vano di membrana definito il Coxiella- contenente vacuolo (CCV). Il CCV richiede traffico endocitico ospite esimogrezzi precoce e tardiva endosomi fino a quando non matura in un organello lisosoma di derivazione ^13. In tutto questo processo, il CCV acquisisce fattori dell'ospite che o appaiono transitoriamente o rimanere connessi con il vacuolo, compresi, ma non limitatamente a, Rab5, Rab7, CD63 e ^LAMP-gennaio 13-15. La replica di Coxiella all'interno di cellule ospiti è interamente dipendente da un Dot / Icm Tipo IVB secrezione sistema completamente funzionante (T4SS) ^8,16,17. Questo sistema di secrezione è una struttura multi-proteina ancestrally relative ai sistemi di coniugazione e si estende su entrambi membrane batteriche e vacuolari per fornire proteine ​​batteriche, definito effettori, nel citoplasma ospitante ^18. Il Coxiella T4SS è funzionalmente molto simile al ben caratterizzato tipo IVB Dot / Icm secrezione Sistema di Legionella pneumophila ^19,20. È interessante notare che l'attivazione del T4SS e successiva effettore traslocazione avviene solo Coxiella raggiunge l'acido lisosoma derivatoorganello, circa 8 ore dopo l'infezione ^17,21. Ad oggi, più di 130 effettori Dot / ICM sono stati identificati ^9,17,22-24. Molti di questi effettori probabilmente svolgono un ruolo importante durante la replica di Coxiella all'interno di cellule ospiti; tuttavia, solo pochi effettori sono stati funzionalmente caratterizzata ^25-29.

In questo studio utilizziamo un saggio di traslocazione di fluorescenza base che si basa sulla scissione del substrato CCF2-AM FRET (di seguito denominato il substrato blam) attraverso attività di β-lattamasi all'interno del citoplasma della cellula ospite (Figura 1). Il gene di interesse è fuso TEM-1 β-lattamasi (blam) su un plasmide giornalista che fornisce espressione costitutiva. Il substrato BLAM è composto da due fluorofori (cumarina e fluoresceina) che formano una coppia FRET. Eccitazione dei risultati cumarinici in FRET della fluoresceina e l'emissione di fluorescenza verde in assenza di effettore traslocazione; Tuttavia, se il BlaM-effector proteina di fusione viene traslocato nel citoplasma ospite, la risultante β-lattamasi attività fende l'anello β-lattamici del substrato Blam, che separa la coppia FRET produrre blu emissione di fluorescenza a seguito di eccitazione. Questo test traslocazione è stato ben dimostrato come un approccio per identificare le proteine ​​effettrici da una gamma di diversi batteri intracellulari ed extracellulari, tra cui C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, enteropatogena E. coli, Salmonella e Brucella ^17,30-35.

Per determinare il ruolo dei fattori di accoglienza specifici su Coxiella effettrici traslocazione utilizziamo un metodo consolidato per silenziamento gene noto come interferenza dell'RNA, in particolare piccoli RNA interferenti (siRNA). Originariamente identificato nel Caenorhabditis elegans, interferenza dell'RNA è un processo cellulare endogena conservato utilizzato per defe innataNSE contro i virus così come gene regolamentazione ^36,37. Dopo il legame di specifiche sequenze siRNA, degradazione del mRNA avviene attraverso RISC (RNA-indotta complesso tacere) con conseguente specifico silenziamento genico o atterramento ^38. In questo studio, siRNA è stato utilizzato per indirizzare due proteine ​​ospitanti, Rab5A e Rab7A, che sono importanti regolatori della via endocitico. L'impatto di tacere Rab5A e Rab7A su effettori traslocazione è stata determinata mediante C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 è stato scelto in quanto è stato precedentemente dimostrato di essere traslocata dal sistema di secrezione Dot / Icm di Coxiella ^17.

Utilizzando sia siRNA silenziamento genico e il saggio di traslocazione fluorescencebased descritto qui, stiamo cominciando a definire un ruolo per fattori di accoglienza nella traslocazione di proteine ​​effettrici da Coxiella. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di entrambi batteri intracellulari ed extracellulari che possiedono secretio similesistemi n responsabili della traslocazione di proteine ​​effettrici.