تطبيق نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق) لدراسة المستجيب إزفاء الكفاءة من قبل<em> الكوكسيلا البورنيتية</em> أثناء سيرنا إسكات

الكوكسيلا البورنيتية هو الممرض داخل الخلايا الفريدة التي تسبب الحيوانية المصدر العدوى البشرية بالحمى. ويرتبط هذا المرض مع طائفة واسعة من العروض السريرية تمتد من الانقلاب المصلي بدون أعراض للعدوى تهدد الحياة المزمن الذي غالبا ما يظهر عن سنوات التهاب الشغاف بعد التعرض ^1. تحدث العدوى البشرية في المقام الأول من خلال استنشاق هباء ملوثة المجترات الخزان الرئيسي للعدوى، ولا سيما، الأبقار والأغنام والماعز. على الرغم من أن العدوى الكوكسيلا في هذه الحيوانات عادة تحت الإكلينيكي، والعدوى قد تسبب الإجهاض والحمل البكتيري كبير داخل السائل الولادة والمشيمة يمكن أن تلوث البيئة المحلية ^1. مثال على مثل هذا التلوث عبء هائل يمكن أن يكون على وحظ الصحة العامة والزراعة والصناعة مؤخرا في اندلاع حمى Q التي وقعت في هولندا ^2. بين عامي 2007 وعام 2010، تم تشخيص أكثر من 4000 حالة إصابة بشرية بالحمى وترتبط هذه الفاشية إلى تلوث كبير من مزارع الماعز ^3. بالإضافة إلى ذلك، الكوكسيلا هو سلاح بيولوجي محتمل، حسب تصنيف المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها، ويرجع ذلك إلى الاستقرار البيئي للبكتيريا والجرعة المعدية منخفضة اللازمة ليسبب الاعتلال والوفيات ⁴ الشديد.

يوجد الكوكسيلا على مرحلتين: أنا الكائنات المرحلة، المعزولة من المصادر الطبيعية، وضراوة للغاية والمرحلة الثانية الكائنات الحية والموهن للغاية في الجسم الحي. على سبيل المثال، وبعد عدة في ممرات المختبر من الكائنات الكوكسيلا البورنيتية تسعة مايل المرحلة الأولى، تم إنتاج المرحلة الثانية البكتيريا التي تحتوي على حذف الكروموسومات لا رجعة فيه مما أدى إلى lipopolysaccharide في اقتطاع (LPS) ^5. هذه السلالة، C. البورنيتية NMII، يشبه ظاهريا إلى المرحلة الأولى في نماذج زراعة الأنسجة ويوفر طريقة أكثر أمانال للباحثين لدراسة المرضية الكوكسيلا في مختبرات ^5. في السنوات الأخيرة عدة اختراقات تقدمت بسرعة مجال علم الوراثة الكوكسيلا. وأبرزها، وتطوير وسائل الإعلام ممحوضة (يحمض المتوسطة السيستين سترات – ACCM-2) سمحت النمو خالية من الخلايا من الكوكسيلا في كل من السائل وعلى وسائل الاعلام الصلبة ^6،7. وأدى ذلك إلى تحسينات مباشرة من الأدوات الجينية المتاحة للالكوكسيلا بما في ذلك نظام التعبير الجيني محرض، ناقلات المكوك وأنظمة ينقول عشوائية ^8-11. وفي الآونة الأخيرة، كما تم تطوير طريقتين لتثبيط الجين المستهدف، مما يمهد الطريق لفحص المرشحين الجينات الفوعة محددة ^12.

وبعد استيعاب من قبل البلاعم السنخية، الكوكسيلا يعيد إلى أرقام عالية داخل حجرة بغشاء يسمى Coxiella- تحتوي على فجوة (لجنة تنسيق المفردات). لجنة تنسيق المفردات يتطلب الاتجار التقامي المضيف عشرالخام الإندوسومات المبكرة والمتأخرة حتى ينضج إلى المستمدة يحلول عضية ^13. وطوال هذه العملية، لجنة تنسيق المفردات تستحوذ على العوامل المضيفة إما أن تظهر بشكل عابر أو تظل مرتبطة فجوة، بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، Rab5، Rab7، CD63 ^وLAMP-13-15 يناير. تكرار الكوكسيلا داخل الخلايا المضيفة يعتمد كليا على نقطة / آي سي إم نوع IVB نظام إفراز تعمل بكامل طاقتها (T4SS) ^8،16،17. هذا النظام إفراز هو بنية متعددة البروتينية ذات العلاقة أجدادهم لأنظمة التصريف وتمتد كل من الأغشية البكتيرية وفجوي لتقديم البروتينات البكتيرية، ووصف المؤثرات، في السيتوبلازم المضيف ^(18). والكوكسيلا T4SS وظيفيا تشبه الى حد بعيد نوع IVB نقطة / نظام إفراز آي سي إم تتميز كذلك من البكتيريا المستروحة ^19،20. ومن المثير للاهتمام، لا تحدث تفعيل T4SS ولاحق المستجيب النبات حتى يصل الكوكسيلا والحمضية-يحلول المشتقةعضية، ما يقرب من 8 ساعات بعد العدوى ^17،21. حتى الآن، وقد تم تحديد أكثر من 130 المؤثرات نقطة / آي سي إم ^{9،17،22-24.} العديد من هذه المؤثرات على الأرجح تلعب أدوارا هامة خلال تكرار الكوكسيلا داخل الخلايا المضيفة؛ ومع ذلك، سوى عدد قليل من المؤثرات تم التعرف على وظيفيا ^25-29.

في هذه الدراسة يمكننا الاستفادة من مضان أساس النبات فحص يعتمد على الانقسام الركيزة CCF2-AM الحنق (المشار إليه فيما بعد الركيزة BlaM) عن طريق النشاط β-اكتاماز داخل سيتوبلازم الخلية المضيفة (الشكل 1). وتنصهر في الجينات التي تهم تيم-1 β-اكتاماز (BlaM) على البلازميد المراسل أن يوفر التعبير التأسيسي. وتتألف الركيزة BlaM اثنين fluorophores (الكومارين وفلوريسئين) التي تشكل زوج الحنق. الإثارة من نتائج الكومارين في الحنق من فلوريسئين والانبعاثات مضان أخضر في غياب النبات المستجيب. ومع ذلك، إذا كان بلوخينتقل إلى M-المستجيب البروتين الانصهار في السيتوبلازم المضيف، الناتجة β-اكتاماز يشق نشاط عصابة β لاكتام الركيزة BlaM، يفصل الزوج الحنق إنتاج الانبعاثات مضان الأزرق بعد الإثارة. وقد تم هذا الاختبار النبات ثبت كذلك نهج لتحديد البروتينات المستجيب من مجموعة واسعة من مختلف البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية، بما في ذلك جيم البورنيتية، L. المستروحة، L. اللونغبيشية، الكلاميديا، ممرض للأمعاء E. القولونية والسالمونيلا والبروسيلا ^17،30-35.

لتحديد دور العوامل المضيفة محددة بشأن الكوكسيلا المستجيب النبات نحن نستخدم طريقة راسخة لإسكات الجينات المعروفة تدخل الحمض النووي الريبي، وخاصة الحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (سيرنا). حددت أصلا في ايليجانس انواع معينة، تدخل الحمض النووي الريبي هو عملية الخلوية الذاتية الحفظ المستخدمة لdefe الفطريةNSE ضد الفيروسات وكذلك الجين تنظيم ^36،37. بعد ربط تسلسل معين سيرنا، وتدهور مرنا يحدث من خلال RISC (الناجم عن الحمض النووي الريبي مجمع إسكات) مما أدى إلى إسكات الجينات المحددة أو ضربة قاضية ^38. في هذه الدراسة، تم استخدام سيرنا لاستهداف اثنين من البروتينات المضيفة، Rab5A وRab7A، وهي منظمات هامة لمسار التقامي. تم التأكد من تأثير إسكات Rab5A وRab7A على النبات المستجيب باستخدام C. البورنيتية pBlaM-CBU0077. وقد تم اختيار CBU0077 كما تبين أنه سبق أن translocated من قبل النظام إفراز نقطة / آي سي إم من الكوكسيلا ^17.

الاستفادة من كل سيرنا إسكات الجينات وفحص النبات fluorescencebased الموصوفة هنا، بدأنا في إنشاء دور للعوامل المضيف في النبات البروتينات المستجيب من الكوكسيلا. ويمكن تطبيق هذا النهج إلى مجموعة واسعة من كل من البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية التي تمتلك secretio مماثلأنظمة ن المسؤولة عن النبات من البروتينات المستجيب.