突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

標的RNAとCas9構築と修復ドナーベクターの作製 gRNAsのクローニング以前に25に述べた原則以下のワクシニアウイルスのN1L遺伝子を標的ガイド-RNA標的配列を設計します。ワクシニアウイルスのゲノムに対してガイドRNA標的配列を整列させる（この場合には、ワクシニアウイルスのLister株）は、任意のオフターゲットgRNA標的配列を排除します。 合成し、以前に25記載されているようにgRNAクローニングベクターにgRNAオリゴクローンを作成。サンガー配列決定33によって得られたベクター内の個々のgRNAのシーケンスを確認してください。 gRNA N2 33として構築結果のgRNAに名前を付けます。 注：gRNA標的部位は、N1L遺伝子内にあり、左腕と右腕との間の領域にあることを修復ドナーベクターカバー（ 図1参照）。 核局在化シグナル（NLS）を欠いているCas9遺伝子をクローニングpST1374ベクトルとPST-Cas9 33のような構造体を指定します。 注：クローニングベクターの任意の哺乳動物発現がCas9発現ベクターの構築のために使用することができます。 HRの修復ドナーベクターの構築修正33のための標的領域としてVVのN1L遺伝子を使用してください。左右のアームの長さが約500から600 bpのそれぞれであることを確認し、ターゲット領域に隣接します。 注：左腕/右腕は、標的領域と最大50 bpのオーバーラップを持つことができます（ 図1を参照してください）。 以前に33、34説明したようにN1L領域修理ドナーベクターのクローンを作成し、PT-N1Lとして修理ドナーベクターを指定します。 注：修理ドナーベクターとその対象領域については、 図1を参照してください。 VVのその他の地域は、地域（遺伝子）特異的gRNA（複数可）および地域固有の修理ドナーベクターを用いて標的とすることができます。任意のクローニングベクターは、修復ドナーベクターの構築のために使用することができます。 </ OL> プラスミドの拡大化学的コンピテントE.にプラスミドをトランスフォームコリ 、製造者の指示に従って。製造業者によって供給されたプロトコルを参照のプラスミド抽出キットを用いてプラスミドを精製します。 2.播種細胞（1日目） 5％COで37℃、5％ウシ胎児血清（FBS）、100 U / mLペニシリン、および100μg/ mLのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でCV-1細胞（サル腎臓線維芽細胞）を、維持します2。 80〜90％のコンフルエントであるトリプシン処理CV-1細胞 CV-1細胞を含有するT-175フラスコから細胞培養培地を除去します。残留血清を除去し、PBSを吸引する滅菌PBS 5mLで単層を洗浄します。セルをカバーし、細胞剥離を補助するために約5分間37℃のインキュベーターにフラスコを置く2.5mLの1×トリプシン-EDTA溶液を加えます。 加えます穏やかなピペット操作によって細胞を懸濁するための細胞培養培地10ml（ステップ2.1参照）。血球計数器を用いて細胞数を数えます。 6ウェルプレート中の細胞を播種 6ウェルプレートの各ウェルに細胞培養培地2mL中のシード2×10 5 CV-1細胞のトランスフェクションの前日。 注：トリプシンを除去するための追加の遠心分離工程を必要としません。 Cas9プラスミドとgRNAプラスミドの3トランスフェクション（2日目） 0.5μgのPST-Cas9プラスミドで、製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いて、0.5μgのgRNA N2プラスミド（ステップ2.2.3.1で調製した）トランスフェクトCV-1細胞。 インキュベーター中で24時間細胞をインキュベート（37℃、5％CO 2）、その後（ステップ2.1参照）新鮮な細胞培養培地2mlで培地を交換してください。 CV-1細胞およびシャトルドナーVの4感染エクタートランスフェクションHRのための（3日目） 2×10 5 PFU / mLの濃度にDMEM細胞培養培地でバックボーンVVL15ウイルスを希釈します。 Cas9とgRNAプラスミドのトランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされたCV-1細胞の各ウェルに希釈したウイルスの100μLを追加します。 2時間後、ウイルス感染、製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を使用してHRためVVL15感染細胞に1.0μgのシャトルドナーベクターをトランスフェクトします。 24時間、5％CO 2で37℃インキュベーターでトランスフェクトされた細胞を置きます。 5.収穫組換えウイルス（4日目） ステップ4.2でのHRのためのシャトルドナーベクターでのトランスフェクションの24時間後、セルスクレーパーを用いてトランスフェクションCV-1細胞を切り離します。クリオバイアルに細胞懸濁液を収集し、将来の使用のために-80℃で保存します。 注：すぐに消毒剤を有する任意の細胞培養培地のこぼれをふき取り、その後、70％エタンで再び拭きオール。 変更されたVV（ファーストラウンド）の6.精製 1日目に、各ウェル中の3×10 5 CV-1細胞を15 6ウェルプレートに播種します。 2日目、3分間37℃の水浴中でステップ5.1からの凍結細胞懸濁液を解凍し、細胞残屑を除去せずに細胞溶解物を得るために、30秒間激しくクリオバイアルをボルテックス。 CV-1細胞の6ウェルプレートの感染のために、DMEM 3mlの細胞溶解物の1μLに希釈し、既に媒体の上に、6ウェルプレートの各ウェルに希釈した細胞溶解物の0.5 mLを加え存在。ステップ6.1で調製した全6ウェルプレートに感染します。 注：細胞破片の除去が必要とされません。 感染の2日後（ すなわち、4日目）、プラークの位置を周回することにより、マーカーペンを使用して、プレートの下プラークを10倍対物レンズを使用して、蛍光顕微鏡下でRFP陽性プラークを同定し、ラベルを付けます。 メモ： <st栄>代表RFP陽性プラークについては、図3。 6異なるRFP陽性プラークをピックアップして、200μLの無血清DMEM細胞培養培地を含む6ラベルされたクライオバイアルを準備します。標識されたプラーク（S）（ステップ6.3）を用いてウェルから細胞培養培地を吸引。 、P200ピペットに200μLチップを取り付けて30μLで音量を設定し、1クライオバイアルから〜10μLの細胞培養培地を取ります。 メディアを解放せず、ピペットのプッシュボタンを押しながら、1ラベルされたプラークの面積を傷つけチップを使用しています。剥離した細胞を持ち上げ、無血清DMEMの190μLを含むクライオバイアルにそれを転送するために、ピペットのプッシュボタンを放します。 （最後のステップからの）傷細胞をバイアルから別の10μL培地を取り、できるだけ多くの傷の細胞を収集するために3回同じRFP陽性プラークを拾うの手順を繰り返します。同じバイアルにすべてのセルを転送し、-80℃でバイアルを格納します。 <br />注：精製の第二ラウンドがすぐに実行された場合に代わり、10分間ドライアイス上で凍結バイアルを凍結します。 変更されたVVの7.精製（2回戦） シード3×10 5 CV-1の各6 6ウェルプレートのウェルと文化への細胞の24時間のための細胞。 細胞溶解物を得るために、30秒間激しくクリオバイアルをボルテックスその後、3分間37℃の水浴中で（ステップ6.3.3）から凍結クリオバイアルを解凍します。 6ウェルプレートの1ウェルに混合細胞溶解液の0.5μLを追加します。各プラークのための1つの6ウェルプレートに感染します。 2日間5％CO 2（第二ラウンドのプラーク精製）を用いて37℃でVV感染6ウェルプレートをインキュベートします。その後、セクション6.3を繰り返します。 注：以上の6 RFP陽性プラークをピックアップすることができます。二つ以上の6ウェルプレートは、各プラークの精製のために使用することができます。 プラークプリ8.さらなるラウンドfication 1陽性のプラークから形成された全てのプラークが顕微鏡下でRFP陽性であるように思われるまで、ステップ7で説明したのと同じプロトコルに従って精製の更なる3〜5回に運びます。 注：その後、このプラークが純粋であると考えられます。 プラークが純粋になると6.3節で説明したように（ 図4、RFPを発現しているすべての感染細胞）を、-80℃で凍結バイアルとストアに正のプラークを収穫します。ステップ9および10に記載されているプロトコル以下のプラークを確認してください。 9.展開し精製したプラーク（複数可） シード3×10 5 CV-1一日ウイルス感染前に6ウェルプレートの各ウェルへの細胞。 細胞溶解物を得るために、3分間37℃の水浴中で8.2から凍結クライオバイアルを解凍します。 CV-1細胞の6ウェルプレートの1ウェルに（細胞破片を除去せずに）すべての溶解液を加える（ステップ9.1に播種）。 5と37℃で感染したCV-1細胞をインキュベート最大3日間％CO 2。 すべての精製されたプラーク（少なくとも3プラーク）を展開します。 注：感染時間は溶解液中のウイルスの量に応じて1〜3日ごとに異なります。 50％以上の細胞が顕微鏡下で観察し、細胞変性効果を示す場合、細胞スクレーパーを用いて、VV感染細胞を収穫（細胞が容易に剥離しRFP陽性の、丸められています）。 15 mLのチューブに細胞培養培地と一緒に剥離した細胞を収集します。 3分間300gで遠心分離により細胞をペレット。上清を除去し、さらに使用するまで-80℃で細胞ペレットを維持するか、ステップ10のためにすぐに細胞ペレットを使用します。 PCRを用いた変異VVの変形例10.検証製造者のプロトコルに従ってDNA抽出キットを用いて、ステップ9.3.1で調製した細胞ペレットからVV DNAを抽出します。二重蒸留水200μLでDNAを溶出します。 注：DNAを抽出し、クローンが正しい修正/挿入を含むものとして検証された場合、ウイルスの生産のための残りを維持するために、ペレットの体積の半分を使用してください。 N1L遺伝子の欠失およびN1L領域にRFP遺伝子の挿入の検証。 N1L遺伝子（L025）とN1L遺伝子に対して設計したプライマーを使用してL026遺伝子にわたるDNA断片を増幅します。 RFP特異的プライマーを使用してRFP遺伝子を増幅します。 A52R特異的プライマーを用いてPCRによりA52Rにわたる制御するDNA断片を増幅します。 注：特異的プライマーのためのマテリアルのリストを参照してください。 PCRマスターミックスキットを用いてPCRを行います。アニールその後、15秒間94℃でDNAを変性：、DNA鋳型の2μLを用いたPCR反応の25μLを設定し、2分間94℃でPCR反応を変性させ、その後、以下の手順に従って30サイクルのPCRを実行します15秒間52℃でのDNAテンプレートのプライマーは、30秒間、72℃でPCR反応を延長します。 1％アガロースゲル33を使用して、PCR産物を解決します。 UVゲルドキュメントを用いたゲル画像をキャプチャします。 N1L PCRが陰性であり、A52R及びRFPのPCRが陽性である場合には、プラークは、正確にN1L領域に変更されます。