Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

1. Préparation de l'ARN cible et cas9 Constructs et réparation Donor Vector Clonage des ARNg Concevoir une séquence cible guide ARN ciblant le gène N1L du virus de la vaccine suivant le principe énoncé précédemment 25. Aligner la séquence cible guide ARN contre le génome du virus de la vaccine (dans ce cas, la souche Lister du virus de la vaccine) pour écarter toutes les séquences hors cible cibles gARN. Synthétiser et cloner oligos gARN dans un vecteur de clonage gARN comme décrit précédemment 25. Confirmer la séquence de chaque individu gARN dans le vecteur résultant par Sanger séquençage 33. Nom du gARN construction résultante comme gARN N2 33. NOTE: Le site cible gARN est dans le gène N1L, et est dans la région entre le bras gauche et le bras droit que les couvertures de vecteur de réparation des donateurs (voir la figure 1). Cloner le gène dépourvu cas9 le signal de localisation nucléaire (NLS) dans lapST1374 vecteur et désigner la construction comme pST-cas9 33. REMARQUE: Toute expression vecteur de clonage de mammifère peut être utilisé pour la construction du vecteur d'expression cas9. Construction d'un vecteur de réparation des donateurs pour les RH Utiliser le gène N1L de VV en tant que région cible pour une modification 33. Faire en sorte que les longueurs des bras gauche et droit sont d'environ 500 à 600 paires de bases chacune, flanquant la région cible. NOTE: Le bras / bras gauche à droite peut avoir jusqu'à 50 pb chevauchement avec la région cible (voir la figure 1). Cloner le vecteur donneur région de réparation N1L comme décrit précédemment 33, 34 et désigner le vecteur donneur de réparation comme pT-N1L. REMARQUE: Voir la Figure 1 pour le vecteur de réparation des donateurs et sa région cible. D'autres régions du VV peuvent être ciblés en utilisant la région (gène) spécifique de gARN (s) et le vecteur de réparation donneur spécifique à la région. Tout vecteur de clonage peut être utilisé pour la construction du vecteur donneur de réparation. </ Ol> Expansion du plasmide Transformer le plasmide dans E. chimiquement compétente coli selon les instructions du fabricant. On purifie le plasmide en utilisant un kit d'extraction de plasmide se référant au protocole fourni par le fabricant. 2. Cellules Seeding (Jour 1) Maintenir cellules CV-1 (fibroblastes de rein de singe) en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de 5% de fœtus bovin (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2. Trypsiniser cellules CV-1 qui sont confluentes à 80-90% Éliminer le milieu de culture de cellules de la fiole T-175 contenant des cellules CV-1. Rincer la monocouche avec 5 ml de PBS stérile pour éliminer le sérum résiduel et aspirez le PBS. Ajouter 2,5 ml de solution 1 × trypsine-EDTA pour couvrir les cellules et placer le ballon dans 37 ° C incubateur pendant environ 5 minutes pour aider le détachement des cellules. Ajouter10 ml de milieu de culture cellulaire (voir étape 2.1) pour les cellules en suspension par une action de pipetage doux. Compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Semis cellules dans des plaques 6 puits Seed 2 × 10 5 cellules CV-1 à 2 ml de milieu de culture cellulaire dans chaque puits d'une plaque à 6 puits le jour avant la transfection. NOTE: Une étape de centrifugation supplémentaire pour éliminer la trypsine est pas nécessaire. 3. Transfection de cas9 plasmide et gARN plasmide (Jour 2) Transfecter des cellules CV-1 (préparé dans l'étape 2.2.3.1) avec 0,5 pg du plasmide pST-cas9 et 0,5 pg de plasmide gARN N2 en utilisant un réactif de transfection selon les instructions du fabricant. Incuber les cellules pendant 24 h dans un incubateur (37 ° C avec 5% de CO 2), puis remplacer le milieu par 2 ml de milieu de culture cellulaire frais (décrit à l' étape 2.1). 4. L'infection de cellules CV-1 et Shuttle Donor Vecteur Transfection pour HR (Jour 3) On dilue le virus VVL15 de squelette avec du DMEM milieu de culture cellulaire à une concentration de 2 x 10 5 pfu / ml. 24 h post-transfection de cas9 et gARN plasmides, ajouter 100 ul du virus dilué dans chaque puits des transfectées cellules CV-1. infection post-virus 2 h, transfecter 1,0 pg vecteur donneur de navette dans les cellules infectées par VVL15 pour HR en utilisant un réactif de transfection selon les instructions du fabricant. Placer les cellules transfectées dans un incubateur à 37 ° avec 5% de CO2 pendant 24 heures. 5. récolte le virus recombinant (Jour 4) Après 24 h de transfection avec le vecteur navette donateurs pour les RH à l'étape 4.2, détacher les transfectées cellules CV-1 en utilisant un grattoir à cellules. Recueillir la suspension cellulaire dans un cryovial et stocker à -80 ° C pour une utilisation future. REMARQUE: Essuyer tout milieu de culture cellulaire déversement avec un désinfectant immédiatement et essuyez ensuite avec 70% ethanol. 6. Purification de la VV modifiée (Premier tour) Au jour 1, des graines de 15 plaques à 6 puits avec 3 x 10 5 cellules CV-1 dans chaque puits. Le jour 2, décongeler la suspension cellulaire congelée de l'étape 5.1 dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 3 min et vortexer les cryotubes vigoureusement pendant 30 s pour obtenir un lysat cellulaire sans enlever les débris cellulaires. Pour l'infection d'une plaque à 6 puits de cellules CV-1, diluer 1 pl de lysat cellulaire avec 3 ml de DMEM et ajouter 0,5 ml de lysat cellulaire dilué dans chaque puits de la plaque de 6 puits, au-dessus des médias déjà présent. Infect toutes les plaques de 6 puits préparés à l'étape 6.1. REMARQUE: L'élimination des débris de cellules n'a pas été nécessaire. Après deux jours de l' infection (ie, le jour 4), identifier les plaques de la DP-positif sous un microscope à fluorescence en utilisant 10X objectif et étiqueter les plaques sous la plaque à l' aide d' un stylo marqueur en encerclant l'emplacement de la plaque. NOTE: Voir <strong> Figure 3 pour la plaque de DP positif représentatif. Préparer six cryotubes étiquetés contenant 200 ul DMEM milieu de culture cellulaire dépourvu de sérum pour ramasser six plaques de DP-positives différentes. Aspirer le milieu de culture cellulaire provenant du puits de plaque marquée (s) (étape 6.3). Fixer une pointe de 200 pi à une pipette P200, régler le volume à 30 pi et de prendre ~ 10 pi de milieu de culture cellulaire d'un cryovial. Maintenez le bouton poussoir pipette sans relâcher le moyen et utilisez la pointe à gratter la surface d'une plaque marquée. Relâchez le bouton pipette de poussée pour soulever les cellules détachées et le transférer dans le cryovial contenant 190 pi de DMEM sans sérum. Prenez un autre 10 moyen ul du flacon avec les cellules grattées (de la dernière étape) et répétez la procédure de prise en charge de la même plaque de DP positif à trois reprises pour collecter autant de cellules grattées que possible. Transférer toutes les cellules dans le même flacon et conserver le flacon à -80 ° C. <br /> NOTE: Vous pouvez également geler les cryotubes sur glace sèche pendant 10 minutes si le second tour de purification est effectuée immédiatement. 7. Purification de la VV modifiée (deuxième ronde) Seed 3 × 10 5 cellules CV-1 dans chaque puits de six plaques de 6 puits et la culture des cellules pendant 24 h. Décongeler les cryotubes congelés (de l'étape 6.3.3) à 37 ° C bain d'eau pendant 3 min, puis vortexer les cryotubes vigoureusement pendant 30 secondes pour obtenir un lysat cellulaire. Ajouter 0,5 pi de lysat cellulaire mixte à un puits d'une plaque à 6 puits. Infect une plaque de 6 puits pour chaque plaque. Incuber les plaques à 6 puits VV-infectées à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 2 jours (Deuxième purification de plaque ronde). Ensuite, répétez la section 6.3. NOTE: Plus de six plaques de DP-positifs peuvent être ramassés; deux ou plusieurs plaques de 6 puits peuvent être utilisées pour la purification de chaque plaque. 8. Autres rounds suivants de Plaque Purification Continuez encore trois à cinq cycles de purification en suivant le même protocole décrit à l'étape 7 jusqu'à ce que toutes les plaques formées à partir d'une plaque positives semblent être RFP positifs au microscope. NOTE: Cette plaque est alors considérée comme pure. Une fois que la plaque est pure (Figure 4, toutes les cellules infectées exprimant RFP), récolte une plaque positive dans un cryovial et conserver à -80 ° C comme décrit dans la section 6.3. Vérifiez la plaque en suivant le protocole décrit à l'étape 9 et 10. 9. Développez le Purifié Plaque (s) Seed 3 × 10 5 cellules CV-1 dans chaque puits d'une plaque à 6 puits un jour avant l' infection par le virus. Décongeler le cryovial congelé de 8,2 dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 3 min pour obtenir un lysat cellulaire. Ajouter tous les lysat (sans enlever les débris cellulaires) dans un puits d'une plaque à 6 puits de cellules CV-1 (tête de série à l'étape 9.1). Incuber les cellules CV-1 infectées à 37 ° C avec 5% De CO2 pendant 3 jours. Développer toutes les plaques purifiées (au moins trois plaques). REMARQUE: La durée de l'infection varie de 1-3 jours en fonction de la quantité de virus dans le lysat. Récolter les cellules infectées par VV à l'aide d'un grattoir cellulaire lorsque plus de 50% des cellules montrent un effet cytopathique observé sous un microscope (cellules sont arrondies, facilement détaché et RFP positif). Recueillir les cellules individuelles avec un milieu de culture cellulaire dans un tube de 15 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min. Retirer le surnageant et conserver le culot cellulaire à -80 ° C jusqu'à utilisation ultérieure ou d'utiliser immédiatement le culot cellulaire pendant l'étape 10. Vérification de la modification du Mutant VV Utilisation PCR 10. Extraire l'ADN de VV le culot de cellules préparée à l'étape 9.3.1 en utilisant un kit d'extraction d'ADN en suivant le protocole du fabricant. Eluer ADN avec 200 pi d'eau distillée deux fois. REMARQUE: Utiliser la moitié du volume de la pastille pour extraire l'ADN et le reste pour maintenir la production virale si le clone est vérifiée comme contenant la modification / insertion correcte. Vérification de la deletion du gène N1L et l'insertion du gène de DP dans la région N1L. Amplifier un fragment d'ADN recouvrant le gène N1L (L025) et le gène L026 en utilisant des amorces conçues contre le gène N1L. Amplifier le gène de la DP en utilisant des amorces spécifique de la DP. Amplifier un fragment d'ADN de contrôle couvrant A52R par PCR en utilisant des amorces spécifiques de A52R. REMARQUE: Voir la liste des matériaux pour des amorces spécifiques. Effectuer la PCR en utilisant un kit maître mélange PCR. Mettre en place 25 pi de réaction de PCR en utilisant 2 pi de matrice d'ADN, dénaturer la réaction PCR à 94 ° C pendant 2 min, puis exécutez 30 cycles de PCR suivants comme suit: dénaturer l'ADN à 94 ° C pendant 15 s, puis recuit les amorces aux matrices d'ADN à 52 ° C pendant 15 s étendent la réaction de PCR à 72 ° C pendant 30 s. Résoudre les produits de PCR en utilisant un gel d'agarose à 1% 33. Capturez l'image de gel en utilisant un doc de gel UV. Si le PCR N1L est négatif et A52R et RFP RFP sont positifs, puis la plaque est correctement modifiée dans la région N1L.