Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

1. Bereiding van Target RNA en Cas9 bouwt en Repair Donor Vector Klonering van gRNAs Ontwerp een gids-RNA-doelsequentie gericht op de N1L gen van vacciniavirus volgens het principe eerder 25 vermeld. Lijn de gids-RNA-doelsequentie tegen het genoom van het vacciniavirus (in dit geval, Lister stam van vacciniavirus) uit te sluiten elke off-target gRNA doelsequenties. Synthetiseren en klonen gRNA oligo in een gRNA kloneringsvector zoals hiervoor 25 beschreven. Bevestigt de sequentie van iedere afzonderlijke gRNA in de resulterende vector van Sanger sequentiebepaling 33. Noem het resulterende gRNA bouwen als gRNA N2 33. OPMERKING: De gRNA doelwitplaats binnen de N1L gen, en in het gebied tussen de linkerarm en de rechterarm dat de reparatie donorvector deksels (zie figuur 1). Kloon de Cas9 gen ontbreekt het nucleair lokalisatie signaal (NLS) in depST1374 vector en wijzen het construct als pST-Cas9 33. Opmerking: Elke zoogdierlijke expressie-kloneringsvector kan worden gebruikt voor de constructie van de expressievector Cas9. De bouw van de reparatie donor vector voor HR Gebruik de N1L gen van VV als het doelgebied voor modificatie 33. Waarborgen dat de lengte van de linker en rechter armen 500-600 bp elk, en flankerende het doelgebied. OPMERKING: De linkerarm / rechterarm kan tot 50 bp overlap met de doelregio hebben (zie figuur 1). Kloon de N1L regio reparatie donor vector zoals eerder 33, 34 beschreven en wijzen de reparatie donor vector als PT-N1L. OPMERKING: Zie figuur 1 voor de reparatie donor vector en zijn doelgebied. Andere regio's van de VV kan worden gericht met behulp van regio (gen) -specifieke gRNA (s) en regiospecifieke reparatie donor vector. Elke kloneringsvector kan worden gebruikt voor de constructie van de reparatie donorvector. </ Ol> Uitbreiding van plasmide Transformeer de plasmide in chemisch competente E. coli volgens de instructies van de fabrikant. Zuiver het plasmide met een plasmide extractie kit verwijzing naar de door de fabrikant geleverde protocol. 2. Seeding Cellen (dag 1) Handhaaf CV-1-cellen (Monkey nierfibroblasten) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, bij 37 ° C met 5% CO 2. Trypsinize CV-1 cellen die 80-90% confluent Verwijder het celkweekmedium van de T-175 kolf die CV-1 cellen. Spoel de monolaag met 5 ml steriel PBS om resten serum te verwijderen en zuig het PBS. Voeg 2,5 ml 1 x trypsine-EDTA-oplossing om de cellen te dekken door de kolf in 37 ° C incubator gedurende ongeveer 5 min tot cel losraken steun. Toevoegen10 ml celkweekmedium (zie stap 2,1) aan de cellen door voorzichtig pipet actie opschorten. Tel het aantal cellen met een hemocytometer. Zaaien cellen in 6-well platen Zaad 2 x 10 5 CV-1-cellen in 2 ml celkweekmedium in elk putje van een 6-wells plaat de dag voor transfectie. Opmerking: Een extra centrifugatie stap om trypsine te verwijderen is niet vereist. 3. Transfectie van Cas9 Plasmid en gRNA Plasmid (dag 2) Transfecteren CV-1-cellen (bereid in stap 2.2.3.1) met 0,5 ug pST-Cas9 plasmide en 0,5 ug plasmide gRNA N2 met een transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in een incubator (37 ° C met 5% CO 2) en vervang het medium door 2 ml vers kweekmedium (in stap 2.1 beschreven). 4. Infectie van CV-1-cellen en Shuttle Donor Vector Transfectie voor HR (dag 3) Verdun de ruggengraat VVL15 virus DMEM celkweekmedium tot een concentratie van 2 x 10 5 pfu / ml. 24 uur na transfectie van plasmiden Cas9 en gRNA, voeg 100 ul van de verdunde virusoplossing in elk putje van de getransfecteerde CV-1 cellen. 2 uur na de virusinfectie, transfecteren 1,0 ug donor shuttle vector in VVL15-geïnfecteerde cellen voor HR gebruikmaking van een transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de getransfecteerde cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 24 uur. 5. De Oogst van het recombinante virus (dag 4) Na 24 uur transfectie met een shuttle vector voor HR donor in stap 4,2, maak de getransfecteerde CV-1 cellen met een cel schraper. Verzamel de celsuspensie in een cryovial en bewaren bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. LET OP: Veeg celkweekmedium gemorst met een ontsmettingsmiddel onmiddellijk en veeg opnieuw met 70% ethanol. 6. Zuivering van de Modified VV (eerste ronde) Op dag 1, zaad 15 6-putjesplaten met 3 x 10 5 CV-1 cellen in elk putje. Op dag 2, dooi bevroren celsuspensie uit stap 5,1 in een waterbad bij 37 ° C gedurende 3 min en de cryobuisjes vortex krachtig gedurende 30 s tot cellysaat te verkrijgen zonder het verwijderen van celresten. Voor het infecteren van een 6-well plaat of CV-1-cellen, verdund 1 pl cellysaat met 3 ml DMEM en voeg 0,5 ml van de verdunde cellysaat in elk putje van de 6-well plaat bovenop media reeds aanwezig. Infect alle 6 putjes bereid in stap 6.1. Opmerking: Het verwijderen van celafval is niet vereist. Na twee dagen van infectie (dwz op dag 4), identificeren RFP-positieve plaques onder een fluorescentie microscoop met 10x objectief en label de plakken onder de plaat met een viltstift omcirkelen de plaque locatie. OPMERKING: Zie <strong> Figuur 3 voor representatieve RFP-positieve plaque. Bereid zes gelabeld cryovials die 200 pi serum-vrij DMEM celcultuur medium op te halen zes verschillende RFP-positieve plaques. Zuig het celkweekmedium uit de put met gemerkt plaque (s) (stap 6,3). Bevestig een 200 pi tip om een ​​P200 pipet, zet het volume op 30 pi en nemen ~ 10 pi celkweekmedium van de ene cryovial. Houd de pipet drukknop zonder het medium en gebruik de tip om het gebied van een label plaque krassen. Laat de pipet drukknop Til de losgemaakte cellen en breng deze in de cryovial met 190 gl serumvrij DMEM. Neem een ​​ander 10 pi medium uit de flacon met de bekraste cellen (van de laatste stap) en herhaal de procedure van het oppakken van dezelfde RFP-positieve plaque drie keer zo veel krassen cellen mogelijk te verzamelen. Breng alle cellen in hetzelfde buisje en bewaar het flesje bij -80 ° C. <br /> OPMERKING: U invriezen cryovials op droog ijs gedurende 10 min wanneer de tweede ronde van zuivering onmiddellijk uitgevoerd. 7. Zuivering van de Modified VV (tweede ronde) Zaad 3 x 10 5 CV-1 cellen in elk putje van zes 6-well platen en kweken van de cellen gedurende 24 uur. Ontdooi de bevroren cryovials (uit stap 6.3.3) bij 37 ° C waterbad gedurende 3 min, daarna worden geschud cryovials krachtig gedurende 30 sec cellysaat te verkrijgen. Voeg 0,5 pi van de gemengde cellysaat één putje van een 6-wells plaat. Infect een 6-wells plaat voor elke plaque. Incubeer de VV-geïnfecteerde 6-well platen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 2 dagen (tweede ronde plaquezuivering). Herhaal dan rubriek 6.3. LET OP: meer dan zes RFP-positieve plaques kan worden opgehaald; twee of meer 6-well platen kunnen worden gebruikt voor de zuivering van elke plaque. 8. Verdere Rondes van Plaque Puricatie Voeren op een verdere 3-5 ronden van zuivering volgens hetzelfde protocol in stap 7 beschreven totdat alle plaques gevormd uit één positieve plaque lijken RFP-positieve onder een microscoop. LET OP: Deze plaquette wordt dan pure beschouwd. Zodra de plaque zuiver (figuur 4, alle geïnfecteerde cellen die RFP), een positieve plaque te oogsten in een cryovial en bewaar bij -80 ° C zoals beschreven in paragraaf 6.3. Controleer de plaque naar aanleiding van de in stap 9 en 10 beschreven protocol. 9. Vouw de Gezuiverd Plaque (s) Zaad 3 x 10 5 CV-1 cellen in elke well van een 6-wells plaat één dag vóór virusinfectie. Ontdooi de bevroren cryovial van 8,2 in een 37 ° C waterbad gedurende 3 min cellysaat te verkrijgen. Voeg alle lysaat (zonder het verwijderen van celresten) in een putje van een 6-wells plaat van CV-1-cellen (uitgezet in stap 9.1). Incubeer de geïnfecteerde CV-1-cellen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende maximaal 3 dagen. Vouw alle gezuiverde plaques (ten minste drie plaques). OPMERKING: De infectie varieert van 1-3 dagen, afhankelijk van de hoeveelheid virus in het lysaat. Oogst de VV-geïnfecteerde cellen met een cel schraper wanneer meer dan 50% cellen vertonen cytopathisch effect waargenomen onder een microscoop (cellen afgerond, gemakkelijk los en RFP positief). Verzamel de vrijstaande cellen samen met celkweekmedium in een 15 ml buis. Pellet de cellen door centrifugeren bij 300 g gedurende 3 minuten. Verwijder de supernatant en houd de celpellet bij -80 ° C tot verder gebruik of gebruik de celpellet onmiddellijk naar stap 10. 10. Verificatie van de Wijziging van Mutant VV Met behulp van PCR Extract VV DNA uit de celpellet bereid in stap 9.3.1 met een DNA extractie kit volgens het protocol van de fabrikant. Elueer DNA met 200 pi van dubbel gedestilleerd water. OPMERKING: Gebruik de helft van het volume van de pellet om DNA te extraheren en houden de rest van virusproductie als de kloon wordt geverifieerd met de correcte wijziging / insertie. Verificatie van de schrapping van de N1L gen en het inbrengen van RFP-gen in de regio N1L. Amplificeren van een DNA-fragment verspreid over de N1L gen (L025) en L026-gen onder toepassing van primers ontworpen tegen N1L gen. Versterken de RFP gen via RFP-specifieke primers. Amplificeren controle DNA-fragment spanning A52R met PCR met gebruik A52R-specifieke primers. OPMERKING: Zie lijst van materialen voor specifieke primers. Voer de PCR met behulp van een PCR master mix kit. Opgericht 25 ul PCR reactie met gebruik 2 pl DNA-matrijs, denatureren de PCR reactie bij 94 ° C gedurende 2 min, en vervolgens 30 cycli van PCR als volgt: denatureren de DNA bij 94 ° C gedurende 15 s en vervolgens gloeien de primers om de DNA-matrijzen bij 52 ° C gedurende 15 s verlengen de PCR reactie bij 72 ° C gedurende 30 s. Oplossen van de PCR producten met behulp van een 1% agarosegel 33. Leg de gel beeld met behulp van een UV-gel doc. Als de N1L PCR negatief is en A52R en RFP PCR positief zijn, wordt de plaque correct gemodificeerd in het gebied N1L.