مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس
Summary
فيروس جدري (VV) وقد استخدم على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية وتحسين صحة الإنسان. توضح هذه المقالة طريقة بسيطة وفعالة للغاية لتحرير الجينوم VV باستخدام نظام كريسبر-Cas9.
Abstract
The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.
Introduction
فيروس جدري (VV) هو فيروس الحمض النووي يلفها عائلة الفيروسة الجدرية وقد لعبت دورا حاسما في واحدة من أعظم الإنجازات في مجال الطب من القضاء على مرض الجدري. في مرحلة ما بعد الاستئصال من مرض الجدري، وقد وضعت VV كناقل لإيصال الجينات لقاحات ضد فيروس نقص المناعة البشرية والأمراض المعدية الأخرى 1-7 عن طريق إدخال جينات من مختلف مسببات الأمراض في ناقلات VV. كما تم استخدامها على نطاق واسع VV كناقل للسرطان العلاج المناعي 8-14 خاصة لتطوير فيروس جدري حال الورم تكرار استهداف الورم. من أجل خلق متجه لقاح فعال مع تحسين الانتقائية لخلايا السرطان، ويطلب تعديلات داخل الجينوم الفيروسي، بما في ذلك الحذف الجينات أو إدخال الجينات العلاجية.
مع تطور تكنولوجيا الحمض النووي والتوصل إلى فهم أفضل لعلم الأحياء الجزيئية وعلم الفيروسات وإدخال دنا غريب في VV تم تحقيق أصلاد باستخدام إعادة التركيب مثلي (HR) في 1980s 15. هذه الطريقة لا تزال تستخدم على نطاق واسع لبناء ناقلات VV. ويتحقق مقدمة من التعديل الوراثي باستخدام ناقلات المكوك للموارد البشرية، والذي يعيد توحيد مع الجينوم VV في الخلايا المصابة مسبقا. ومع ذلك، فقد أثبتت هذه الطريقة أن تكون فعالة للغاية (أقل من 1٪ كفاءة إعادة التركيب مثلي 16) وغالبا ما يؤدي إلى الإدراج عشوائية من علامة التحديد في المناطق و / أو فقدان علامة على التوسع فيروس غير المستهدفة.
كفاءة من الحمض النووي إعادة التركيب مثلي لإدخال الحمض النووي الخارجية في مواضع الجيني يمكن أن تتعزز بشكل كبير في وجود فواصل مزدوج الجديلة (DSBs) 17. ولذلك، فإن التكنولوجيا التي يمكن أن تحدث DSBs في مواضع الهدف يحمل إمكانات كبيرة للهندسة الجينات من VV.
ويبين النظام كريسبر-Cas9 وضعت مؤخرا الوعد لتحريك DSBs في أي منطقة VV الجينات. كريسبر-Cas9 هو RNA-نوكلياز الموجهة تشارك في المناعة التكيفية ضد غزو فاجات والمواد الوراثية الأجنبية الأخرى 18-20. هناك ثلاثة أنظمة كريسبر-CAS في مجموعة من الأنواع الميكروبية 21. ويستخدم على نطاق واسع في نظام كريسبر-كاس من النوع الثاني لتحرير جينوم الخلايا حقيقية النواة والفيروسات كبيرة. وهو يتألف من Cas9 نوكلياز داخلية موجهة RNA (من المكورات العقدية المقيحة)، الحمض النووي الريبي واحد دليل (sgRNA) وcrRNA تفعيل عبر (tracrRNA) 22-24. يعترف المجمع Cas9 / sgRNA ومكملة 20 النوكليوتيدات الجيني تسلسل السابقة سلسلة 5'-NGG-3 "Protospacer عزر المجاور (PAM) في خلايا الثدييات 22 و 23. وقد تم استخدامه بنجاح لتوليد فعالية الخلايا المعدلة وراثيا، والفيروسات والنماذج الحيوانية 22-32.
وقد ثبت أن نظام كريسبر-Cas9 أن تكون أداة فعالة لجينوم تستهدف في تركيبة مع إعادة التركيب مثلي في سيتوبلازم الخلية VV إصابة CV-1الصورة لتوليد فيروسات جدري متحولة 33، 34. من أجل توسيع إمكانية تطبيق هذه الطريقة، ونحن تقديم معلومات مفصلة حول منهجية هذا النظام. بروتوكول صفها يمكن استخدامها لإنشاء VV متحولة مع حذف جينات معينة و / أو تسليح الفيروس متحولة مع التحوير العلاجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك نوعان من الأهداف الرئيسية بشأن تعديل VV لأغراض علاجية. واحد هو لحذف جينات معينة، مثل الجين ثيميدين كيناز (TK) للتخفيف فيروس للاستخدام العلاجي المضادة للورم. والآخر هو لتسليح VV مع الجين المطلوب العلاجية (مثل GM-CSF) أو الجين علامة (مثل الجينات وسيفيراز). تحقيق أي من هذه ينطوي على حذف منطقة الهدف / الجينات. وقد تم استخدام الحمض النووي المباشر طريقة ربط 35 وفي المختبر طريقة التعبئة والتغليف 36 سابقا لتوليد فيروسات جدري متحولة مع التعديلات TK الجينات. ومع ذلك، وهذه الأساليب قد حدت تطبيق فيما يتعلق طفرة في مناطق أخرى في الجينوم نظرا لعدم وجود مواقع الانزيم تقييد فريدة من نوعها عبر الجينوم. النهج الحالي لخلق VV متحولة يتضمن ترنسفكأيشن من ناقلات المكوك (المانحة) مع علامة الاختيار (طلب تقديم العروض أو GFP) في CV-1 الخلايا بعد ساعتين الإصابة بفيروس VV للحث على incorporati إعادة التركيب مثلينانوغرام علامة اختيار في المنطقة المستهدفة. ويتبع اختيار ويحات علامة إيجابية من قبل على تنقية 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. عملية تنقية لوحة يمكن أن تصل إلى 10 طلقة، 3-4 أسابيع الماضية، وغالبا ما يؤدي إلى فيروسات المؤتلف غير مرغوب فيها مع علامات اختيار إدراجها في المناطق بعيدا عن الهدف. يمكن أن الحمض النووي فواصل مزدوج الجديلة تحفز على نحو فعال إعادة التركيب مثلي في خلايا الثدييات 37، وتسخير هذه الآلية، وكفاءة توليد VV متحولة يمكن تحسينها بشكل كبير. وقد تم استخدام نظام Cas9 gRNA الموجهة بنجاح في تحرير الجينوم، ويعزز من كفاءة إعادة التركيب مثلي في الكائنات حقيقية النواة 22 و 25. وفي الآونة الأخيرة، في الخلايا المضيفة جينومات اتش والنوع الأول تم تحريرها فيروس الهربس البسيط من قبل Cas9 الموجهة gRNA- نظام 24 ساعة. وقد ثبت مؤخرا أن نظام كريسبر Cas9 هو أداة قوية لتحرير بكفاءة الجينوم VV وبناء ناقلات VV للتعبير عنجين معين.
أدى كل من Cas9 الموجهة gRNA-N1L والطريقة التقليدية إعادة التركيب مثلي (HR) في أحداث الموارد البشرية الناجحة في نفس الموقع المستهدف من N1L. ومن المثير للاهتمام، ولكن gRNA موجهة Cas9 الموارد البشرية التي يسببها في مستويات أعلى بكثير من كفاءة من الطريقة التقليدية للموارد البشرية. وهكذا، فإن استخدام Cas9 الموجهة gRNA-يلغي الحاجة إلى تنقية العديد من اللوحات للحصول على VVS متحولة. في هذا العمل، ونحن كثيرا في تحسين كفاءة والإطار الزمني لجيل من VV متحولة باستخدام نظام Cas9 الموجهة gRNA-33. وتجدر الإشارة، خطوة واحدة حاسمة للحصول على كفاءة عالية من إعادة التركيب مثلي هي ل transfect CV-1 الخلايا مع البلازميدات معربا عن Cas9 وgRNA لمدة 24 ساعة قبل تنفيذ إعادة التركيب مثلي التقليدية. الفاصل الزمني 24 ساعة يسمح Cas9 وgRNA أن يتم التعبير عند مستوى معقول. وعلاوة على ذلك، قد تكون هناك حاجة إلى أن يكون الأمثل تسلسل gRNA تستهدف جينات معينة كما وجدنا أن gRNA مختلفة تسلسل رargeting N1L الجينات تختلف في فعاليتها 33 و 34.
الحد لكريسبر / Cas9 في VV التحرير هو انخفاض معدل ويحات طلب تقديم العروض الايجابية في الجولة الأولى من إعادة التركيب. للحصول على عدد كاف من ويحات طلب تقديم العروض الايجابية التي تحتوي على الفيروس المؤتلف، وعادة ما لا يقل عن عشرة هناك حاجة إلى 6 لوحات جيدة، مما يجعل الجولة الأولى فحص مملة. وبالتالي، لا يزال هناك حاجة لتحسين بروتوكول للتغلب على هذا القيد.
صغر حجم ويحات طلب تقديم العروض الإيجابي هو مشكلة محتملة أخرى، والذي يرجع إلى ارتفاع حجم المحللة استخدم لإصابة لوحة 6 جيدا. للتغلب على هذا، يجب استخدام أصغر حجم المحللة أن تصيب لوحة 6 جيدا للحصول على أكبر حجم ويحات طلب تقديم العروض الايجابية. وسوف تستخدم حجم أصغر من المحللة أيضا تمكين للانفصال أفضل لويحات طلب تقديم العروض إيجابية من تلك، طلب تقديم العروض السلبي. ونتيجة لذلك هناك حاجة جولات أقل من تنقية البلاك الحصول ويحات طلب تقديم العروض الايجابية نقية.
<pالطبقة = "jove_content"> بعيدا عن الهدف الآثار هي دائما مسألة غير المرغوب فيها في تحرير الجين. وقد أظهرت كريسبر-Cas9 الآثار بعيدا عن الهدف. ومع ذلك، مع تصميم دقيق للgRNA، بعيدا عن الهدف الآثار التي يمكن تجنبها عند تحرير VV الجينوم 33، 34. وهذه هي فائدة خاصة لاستخدام نظام Cas9 الموجهة gRNA لتحرير جينوم VV. وبالنظر إلى وعود من VV، وذلك باستخدام كريسبر / نظام Cas9 سوف تسرع تطوير VVS متحولة للبحوث الطبية الحيوية والطب متعدية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مثل هذا النظام أيضا الإسراع الاكتشافات في بيولوجيا الخلايا، مثل تشريح مسارات الإشارات التي تستخدمها VV عن الحركة القائمة على الأكتين لها.Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).
Materials
| Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
| pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
| pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E .Coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
| Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
| fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
| penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
| Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
| Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
| fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
| Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
| 10cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
| 6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
| cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
| 1XTrypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
| Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
| Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
| N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
| N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
| A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
| A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
| G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |
References
- Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. . Brock biology of microorganisms, 9th edn. , (2000).
- Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
- Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
- Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
- Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
- Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
- Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
- Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
- Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
- Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
- Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
- Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
- Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
- Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
- Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
- Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).
- Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
- Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
- Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).
