Eliciando e Analisando Canções de Vocalização Ultrassônica de Rato Masculino (USV)
Summary
Os ratos produzem um complexo repertório multisilábico de vocalizações ultra-sônicas (USVs). Estes USVs são amplamente utilizados como leituras para transtornos neuropsiquiátricos. Este protocolo descreve algumas das práticas que aprendemos e desenvolvemos para consistentemente induzir, coletar e analisar as características acústicas e sintaxe de canções de mouse.
Abstract
Os ratos produzem vocalizações ultra-sônicas (USVs) em uma variedade de contextos sociais ao longo do desenvolvimento e da idade adulta. Estes USVs são usados para a recuperação 1 da mãe-filhote, interações juvenis 2 , interações opostas e do mesmo sexo 3 , 4 , 5 , e interações territoriais 6 . Durante décadas, os USVs têm sido utilizados pelos investigadores como proxies para estudar neuropsiquiátricos e transtornos comportamentais ou de desenvolvimento 7 , 8 , 9 e, mais recentemente, para compreender mecanismos e evolução da comunicação vocal entre os vertebrados 10 . Dentro das interações sexuais, ratos machos adultos produzem canções USV, que têm algumas características semelhantes às canções de namoro de aves canoras 11 . A utilização de tal repertório multisilábicoToires pode aumentar a flexibilidade potencial ea informação que carregam, porque podem ser variados em como os elementos são organizados e recombined, a saber syntax. Neste protocolo é descrito um método confiável para a obtenção de canções USV de ratos machos em vários contextos sociais, tais como exposição a urina feminina fresca, animais anestesiados e fêmeas em estro. Isto inclui condições para induzir uma grande quantidade de sílabas dos ratinhos. Reduzimos a gravação de ruídos ambientais com câmaras de som de baixo custo e apresentamos um método de quantificação para detectar, classificar e analisar automaticamente os USVs. Este último inclui a avaliação da taxa de chamada, repertório vocal, parâmetros acústicos e sintaxe. Várias abordagens e insights sobre o uso de reproduções para estudar a preferência de um animal por tipos de canções específicas são descritos. Estes métodos foram utilizados para descrever alterações acústicas e de sintaxe em diferentes contextos em camundongos machos e preferências de canções em ratinhos fêmeas.
Introduction
Em relação aos seres humanos, os ratinhos produzem vocalizações de frequências baixas e altas, as mais tarde conhecidas como vocalizações ultra-sônicas (USVs) acima da nossa faixa auditiva. Os USVs são produzidos em uma variedade de contextos, incluindo de mãe-pup retrieval, interações juvenis, ao oposto ou mesmo sexo adulto interações 4 , 12 . Estes USVs são compostos de um repertório multisilábico diverso que pode ser categorizado manualmente 9 ou automaticamente 10 , 11 . O papel destes USVs na comunicação tem estado sob crescente investigação nos últimos anos. Estes incluem o uso de USVs como leituras de mouse modelos de transtornos neuropsiquiátricos, de desenvolvimento ou comportamentais 7 , 8 , internos e motivacionais / estados emocionais [ 13] . Os USVs são pensados para transmitir informações confiáveis sobre o eQue é útil para o receptor 14 , 15 .
Em 2005, Holy e Guo 11 , avançaram a idéia de que os ratos machos adultos USVs foram organizados como uma sucessão de elementos de chamada multisilábica ou sílabas semelhantes aos pássaros canoras. Em muitas espécies, um repertório multisilábico permite ao emissor combinar e ordenar sílabas de diferentes maneiras para aumentar as informações potenciais transportadas pela música. Acredita-se que a variação nesta sintaxe tenha uma relevância etológica para o comportamento sexual e as preferências de mate 16 , 17 . Estudos posteriores mostraram que os ratos machos foram capazes de alterar a composição relativa dos tipos de sílaba que produzem antes, durante e depois da presença de uma fêmea 5 , 18 . Ou seja, os ratos machos adultos usam seus USVs para comportamento de namoro, seja para atrairOu manter contato próximo com uma fêmea, ou para facilitar o acasalamento 19 , 20 , 21 . Eles também são emitidos nas interações homem-macho, provavelmente para transmitir informações sociais durante as interações 4 . Para captar essas mudanças nos repertórios, os cientistas geralmente medem as características espectrales (parâmetros acústicos, como amplitude, freqüências, etc. ), número de sílabas ou chamadas de USVs e latência para o primeiro USV. No entanto, poucos realmente olhar para a dinâmica de seqüência destes USVs em detalhe 22 . Recentemente, nosso grupo desenvolveu um novo método para medir mudanças dinâmicas nas seqüências de sílaba USV 23 . Mostramos que a ordem da sílaba dentro de uma canção sobre (ou seja, a sintaxe) não é aleatória, que muda dependendo do contexto social, e que os animais ouvintes detectam essas mudanças como sendo etologicamente relevantes.
Nós notamosEm muitos investigadores que estudam a comunicação animal não atribuem ao termo "sintaxe" o mesmo significado exato que a sintaxe usada na fala humana. Para estudos de comunicação animal, nós simplesmente queremos dizer uma sequência ordenada, não-aleatória de sons com algumas regras. Para seres humanos, além disso, as sequências específicas são conhecidas por terem significados específicos. Não sabemos se esse é o caso dos ratos.
Neste artigo e vídeo associado, pretendemos fornecer protocolos fiáveis para gravar os camundongos machos em vários contextos e fazer reproduções. O uso de três software utilizado sequencialmente para: 1) gravações automatizadas; 2) detecção e codificação de sílabas; E 3) análise em profundidade das características da sílaba e sintaxe é demonstrada ( Figura 1 ). Isso nos permite aprender mais sobre a estrutura e função do USV camundongos. Acreditamos que tais métodos facilitam a análise de dados e podem abrir novos horizontes na caracterização da comunicação vocal normal e anormalSe modelos de comunicação e distúrbios neuropsiquiátricos, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece abordagens para coletar, quantificar e estudar vocalizações macho namoro namoro no laboratório em uma variedade de estímulos, principalmente feminino-relacionados. Conforme apresentado anteriormente em Chabout, et al. 23 e nos resultados representativos, o uso deste método nos permitiu descobrir vocalizações contextuais e sintaxe que importam para as fêmeas receptoras. A padronização desses estímulos proporcionará a coleta de um número confiável de USVs e permitirá análises detalhadas das canções e repertórios do namoro masculino.
Quando uma fêmea viva está presente com o macho, o protocolo não nos permite identificar claramente o emissor das vocalizações. No entanto, estudos anteriores mostraram que a maioria das vocalizações emitidas nesse contexto eram do sexo masculino 26 , 29 . A maioria dos estudos usando um congênero (masculino ou feminino)Como um estímulo para os machos acreditam que a quantidade de vocalizações femininas nesses contextos é desprezível 4 , 5 , 22 , 30 . No entanto, um artigo recente usou a triangulação para localizar a vocalização do emissor em condições de alojamento em grupo 31 e mostrou que dentro de uma díade, a fêmea contribui para ~ 10% dos USVs. No presente protocolo o uso da fêmea anestesiada permite ao usuário estudar as vocalizações masculinas na presença de uma fêmea sem sua vocalização. Em contraste com as expectativas deste estudo recente 31 , não encontramos diferença no número de sílabas emitidas entre as condições FE e AF 23 . É possível que as fêmeas vivas não contribuíram significativamente para as gravações ou que os machos vocalizaram menos na presença de fêmeas vivas versus fêmeas anestesiadasAles No entanto, acreditamos que futuras experiências devem considerar o uso deste método de triangulação para avaliar o efeito potencial da contribuição feminina.
Há outros softwares disponíveis que podem fazer algumas das etapas que descrevemos, embora não acreditemos de forma suficiente para as perguntas que fizemos usando uma combinação de três programas: Software A, Mouse Song Analyzer software C usando o software B Software de análise de sintaxe usando cálculos de D + E de um software de planilha personalizado e decodificação de sintaxe usando R. Por exemplo, um artigo recente propôs um software chamado VoICE que permite ao usuário extrair variáveis acústicas automaticamente a partir dos sonogramas ou diretamente em unidades que tinham sido manualmente Selecionado pelo usuário 32 . Mas, as análises de seqüência automatizadas ou semi-automatizadas não são tão detalhadas quanto a nossa abordagem. Alguns softwares comerciais podem analisar automaticamente os recursos acústicos, mas não fornecemClassificação das sílabas; O usuário tem que classificar as diferentes sílabas depois. Grimsley, Gadziola, et ai. 33 desenvolveu um programa de órgão vocal de rato virtual baseado em mesa que agrupa sílabas baseadas em características acústicas compartilhadas, mas não fornece detecção automática das sílabas. Seu programa 34 é único porque cria novas sequências de músicas gravadas usando modelos de Markov e, portanto, possui recursos mais avançados do que simples edição.
A maioria dos estudos prévios de comunicação em ratos concentrou-se no lado do emissor 35 , 36 . Poucos estudos exploraram o lado do receptor 30 , 37 , 38 . Os protocolos de reprodução e discriminação fornecem um teste simples para estudar o lado do receptor, como o descrito também recentemente por Asaba, Kato, etAl. 39 . Nesse estudo, os autores usaram uma caixa de teste de duas opções separada com espuma acústica em vez da caixa Y-labirinto descrita aqui. Ambas as configurações de escolha têm vantagens e desvantagens. Primeiro, o labirinto Y não isolar o som de um braço para o outro, mas a caixa de duas opções faz. No entanto, usando o design Y-labirinto, o animal pode rapidamente avaliar as duas músicas que são tocadas simultaneamente, e avançar para o preferido. No entanto, experimentos de reprodução em geral ajudam os experimentadores a determinar o significado e, portanto, as funções das vocalizações geradas para animais conspécificos. Em conclusão, após dominar as técnicas deste protocolo e análises, os leitores devem ser capazes de abordar muitas questões que influenciam o contexto, genética e neurobiologia de USVs mouse.
Usando ratos B6D2F1 / J, os estímulos associados femininos quase sempre provocam USVs dos machos testados em nosso laboratório. É crítico paraCt sílabas suficientes (> 100 em 5 min) para ser capaz de obter forte análise estatística. Para solução de problemas, se nenhum USVs for gravado (ou não o suficiente), verifique a configuração para certificar-se de que os sons são gravados. Fazer uma inspeção ao vivo do que está acontecendo na gaiola durante a gravação, olhando para o ultra-som em tempo real na tela do computador após a introdução do estímulo. Caso contrário, tente re-expor o macho a uma fêmea sexualmente madura / receptiva durante a noite e depois deixá-los sozinhos por vários dias ou até uma semana antes de gravar novamente. Com base em observações anedóticas, descobrimos que alguns machos cantam muito em um dia (por quase todos os 5 min), e não muito no dia seguinte e, em seguida, novamente outro dia. Nós não sabemos a razão pela qual tal variabilidade sujeito dentro ocorre, mas supomos que é provavelmente um motivacional ou sazonal para os homens, eo estado de estro para a urina feminina. Se nenhum USVs for gravado, tente gravar o animal em vários dias para pegar esses efeitos variáveis. NãoIke nas aves canoras, não observamos diferenças evidentes na quantidade de canto com base na hora do dia. Descobrimos que os machos não cantam muito (<100 sílabas em 5 min) antes de terem 7 semanas de idade.
Os métodos de detecção apresentados aqui podem extrair milhares de sílabas e todos os parâmetros acústicos em poucos minutos. Mas como qualquer método de detecção automática, é muito sensível ao ruído de fundo. O uso do software de detecção de Song Song com gravações barulhentas (por exemplo, de animais gravados com camas) pode exigir ajuste do "limiar" de detecção para permitir mais flexibilidade. No entanto, isso também aumentará o número de sílabas falso-positivas ea detecção automática poderá falhar. Em tais circunstâncias, a codificação manual pode ser usada.
Como mencionado anteriormente, o número, os repertórios e a latência das vocalizações são amplamente variáveis dependendo da tensão, assim, pode-se ter que mudar os parâmetros (comprimento da gravação,Estímulo, detecção automatizada de sílabas, etc. ) para algumas cepas para garantir gravações óptimas para análises estatísticas.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Howard Hughes Medical Institute fundos para EDJ. Agradecemos ao Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI – Universidade Paris sul XI – França) por nos emprestar o hardware do alto-falante. Agradecemos também aos membros do Laboratório Jarvis por seu apoio, discussões, correções e comentários sobre este trabalho, especialmente Joshua Jones Macopson para ajuda com figuras e testes. Agradecemos ao Dr. Gustavo Arriaga pela ajuda com o software Mouse Song Analyzer, atualizando-o para a V1.3 e outros aspectos deste protocolo. V1.0 do software foi desenvolvido por Holy e Guo, e v1.1 e v1.3 por Arriaga.
Materials
| Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
| Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
| Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
| Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
| Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
| plexiglas separation | home made | – | 4 x 13 cm plexiglas with 1cm holes |
| Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
| Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
| Y-maze | Home made | – | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
| Tweezers | |||
| Software | |||
| Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | – | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
| Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_v1.3-2015-03-23.zip | |
| Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
| Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
| Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis – in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
| Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http:// www.graphviz.org; | |
| Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| Reagents | |||
| Xylazine (20mg/ml) | Anased | – | |
| Ketamine HCL (100mg/ml) | Henry Schein | #045822 | |
| distilled water | |||
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
| Cotton tips | |||
| Petri dish |
References
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