Eliciting e analisi di canzoni ad ultrasuoni (USV) di topo maschio
Summary
I topi producono un complesso repertorio multisilabico di vocalizzazioni ultrasoniche (USVs). Questi USV sono ampiamente usati come letture per i disturbi neuropsichiatrici. Questo protocollo descrive alcune delle pratiche apprese e sviluppate per indurre, raccogliere e analizzare costantemente le caratteristiche acustiche e la sintassi delle canzoni del mouse.
Abstract
I topi producono vocalizzazioni ultrasoniche (USVs) in una varietà di contesti sociali durante lo sviluppo e l'età adulta. Questi USV sono utilizzati per il recupero madre-pup, 1 , le interazioni giovanili 2 , le interazioni opposte e le stesse interazioni di sesso 3 , 4 , 5 e le interazioni territoriali 6 . Per decenni i USVs sono stati usati dagli investigatori come proxy per studiare i disturbi neuropsichiatrici e di sviluppo o comportamentali 7 , 8 , 9 e più recentemente per comprendere i meccanismi e l'evoluzione della comunicazione vocale tra i vertebrati 10 . Nell'ambito delle interazioni sessuali, i topi maschi adulti producono canzoni USV, che presentano alcune caratteristiche simili alle canzoni di canto da cortile 11 . L'uso di tale reper multisilabicoI giocatori possono aumentare la potenziale flessibilità e le informazioni che portano, in quanto possono essere variate in come gli elementi sono organizzati e ricombinati, vale a dire la sintassi. In questo protocollo è descritto un metodo affidabile per elicitare canzoni USV da topi maschi in vari contesti sociali, come esposizione a urine fresche femminili, animali anestetizzati e femmine estrusse. Ciò include condizioni per indurre una grande quantità di sillabe dai topi. Riduciamo la registrazione dei rumori ambientali con camere a basso costo e presentiamo un metodo di quantificazione per rilevare, classificare e analizzare automaticamente gli USV. Quest'ultimo include la valutazione del call-rate, del repertorio vocale, dei parametri acustici e della sintassi. Sono descritti diversi approcci e approfondimento sull'uso delle riproduzioni per studiare la preferenza di un animale per tipi di song specifici. Questi metodi sono stati utilizzati per descrivere cambiamenti acustici e sintattici in diversi contesti nei topi maschi e preferenze canzoni nei topi femminili.
Introduction
Rispetto agli esseri umani, i topi producono sia vocalizzazioni basse che ad alta frequenza, più tardi chiamate vocalizzazioni ultrasoniche (USV) sopra la nostra gamma uditiva. Gli USV sono prodotti in una varietà di contesti, tra cui da recupero madre-pup, interazioni giovanili, interazioni adulte opposte o stesse del sesso 4 , 12 . Questi USV sono composti da un repertorio multisilabo diversificato che può essere classificato manualmente 9 o automaticamente 10 , 11 . Il ruolo di questi USV nella comunicazione è stato in atto da indagini crescenti negli ultimi anni. Questi includono l'utilizzo degli USV come letture di modelli di topo dei disturbi neuropsichiatrici, di sviluppo o comportamentali 7 , 8 e di stati motivazionali / emotivi interni 13 . Si pensa che gli USV trasmettano informazioni attendibili sull'eStato di mittente che è utile per il ricevitore 14 , 15 .
Nel 2005, Santo e Guo 11 hanno avanzato l'idea che i maschi adulti maschi degli Usa vennero organizzati come una successione di elementi di chiamata multisilabica o sillabe simili a canzoni da canto. In molte specie, un repertorio multisilabico consente all'emettitore di combinare e ordinare le sillabe in modi diversi per aumentare le informazioni potenziali trasportate dalla canzone. Si ritiene che la variazione in questa sintassi abbia una rilevanza etologica per il comportamento sessuale e le preferenze del compagno 16 , 17 . Gli studi successivi hanno mostrato che i topi maschi hanno potuto modificare la composizione relativa dei tipi di sillabazione che producono prima, durante e dopo la presenza di una femmina 5 , 18 . Cioè, i topi maschi adulti usano i loro USV per comportamenti di corteggiamento, sia per attirareO mantenere un contatto stretto con una femmina, o per facilitare l'accoppiamento 19 , 20 , 21 . Esse sono emesse anche nelle interazioni maschili e maschili, probabilmente per trasmettere informazioni sociali durante le interazioni 4 . Per catturare questi cambiamenti nei repertori, gli scienziati misurano normalmente le caratteristiche spettrali (parametri acustici, quali ampiezza, frequenze, ecc. ), Il numero di sillabe o chiamate degli USV e la latenza al primo USV. Tuttavia, pochi in realtà considerano le dinamiche di sequenza di questi USV in dettaglio 22 . Recentemente il nostro gruppo ha sviluppato un metodo nuovo per misurare i cambiamenti dinamici nelle sequenze sillabali USV 23 . Abbiamo mostrato che l'ordine di sillabazione all'interno di una canzone (cioè la sintassi) non è casuale, che cambia a seconda del contesto sociale e che gli animali ascolti rilevano questi cambiamenti come etologicamente rilevanti.
Noi notiamo thA molti investigatori che studiano la comunicazione animale non attribuiscono al termine "sintassi" lo stesso significato esatto della sintassi utilizzata nel discorso umano. Per gli studi sulla comunicazione animale, si intende semplicemente una sequenza ordinata e non casuale di suoni con alcune regole. Per gli esseri umani, inoltre, le sequenze specifiche sono note per avere significati specifici. Non sappiamo se questo è il caso per i topi.
In questo documento e nel video associato, ci proponiamo di fornire protocolli affidabili per registrare i contatti USV di corteggiamento maschile dei maschi in diversi contesti e eseguire le riproduzioni. L'utilizzo di tre software sequenzialmente usati per: 1) registrazioni automatiche; 2) sillabe rilevazione e codifica; E 3) è stata dimostrata un'analisi approfondita delle caratteristiche di sillabazione e della sintassi ( Figura 1 ). Questo ci permette di saperne di più sulla struttura e la funzione USV dei topi maschi. Crediamo che tali metodi facilitino l'analisi dei dati e possono aprire nuovi orizzonti nel caratterizzare la normale comunicazione anormale e vocale in mouSe modelli di comunicazione e disturbi neuropsichiatrici, rispettivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce approcci per raccogliere, quantificare e studiare vocalizzazioni maschili di corteggiamento di topi maschi in laboratorio attraverso una serie di stimoli principalmente legati alle donne. Come precedentemente presentato in Chabout, et al. 23 e nei risultati rappresentativi, l'uso di questo metodo ci ha permesso di scoprire vocalizzazioni e sintassi dipendenti dal contesto che sono rilevanti per le femmine riceventi. La standardizzazione di questi stimoli fornirà la raccolta di un numero affidabile di USV e consentirà analisi dettagliate delle canzoni e dei repertori del corteggiamento maschile.
Quando una femmina viva è presente con il maschio, il protocollo non ci consente di identificare chiaramente l'emettitore delle vocalizzazioni. Tuttavia, gli studi precedenti hanno mostrato che la maggior parte delle vocalizzazioni emesse in tale contesto erano da parte del maschio 26 , 29 . La maggior parte degli studi con un conspecifico (maschio o femmina)Come stimolo per i maschi ritengono che la quantità di vocalizzazioni femminili in questi contesti sia trascurabile 4 , 5 , 22 , 30 . Tuttavia un recente studio ha utilizzato la triangolazione per localizzare le vocalizzazioni dell'emettitore nelle condizioni di gruppo 31 , e ha mostrato che all'interno di un dyad, la femmina contribuisce al ~ 10% degli USVs. Nel presente protocollo l'uso della femmina anestetizzata consente all'utente di studiare le vocalizzazioni maschili in presenza di una donna senza la sua vocalizzazione. A differenza delle aspettative di questo recente studio 31 , non abbiamo trovato alcuna differenza nel numero di sillabe emesse tra le condizioni FE e AF 23 . È possibile che le femmine vive non contribuiscano in modo significativo alle registrazioni o che i maschi hanno vocalizzato meno in presenza di femmine vive contro femorale anestetizzatoAles. Ciononostante, riteniamo che gli esperimenti futuri dovrebbero considerare l'uso di questo metodo di triangolazione per valutare l'effetto potenziale del contributo femminile.
Ci sono altri software disponibili che possono fare alcuni passi che abbiamo descritto, anche se non crediamo in un modo sufficiente per le domande che abbiamo chiesto usando una combinazione di tre programmi: Software A, Mouse Song Analyzer script C utilizzando il software B, Software di analisi di sintassi che utilizza un calcolo D + E dei programmi di calcolo personalizzato e la decodifica di sintassi con R. Ad esempio, un documento recente ha proposto un software denominato VoICE che consente all'utente di estrarre automaticamente le variabili acustiche dai sonogrammi o direttamente su unità manualmente Selezionato dall'utente 32 . Ma le analisi di sequenza automatica o semi-automatizzata non sono dettagliate del nostro approccio. Alcuni software commerciali possono analizzare automaticamente le caratteristiche acustiche, ma non forniscono un automobileClassificazione delle sillabe; L'utente deve ordinare successivamente le diverse sillabe. Grimsley, Gadziola, et al. 33 ha sviluppato un programma organico vocale virtuale a base di tabella basato su funzionalità acustiche condivise, ma non fornisce la rilevazione automatica delle sillabe. Il loro programma 34 è unico in quanto crea sequenze nuove da brani registrati usando modelli Markov e quindi ha funzioni più avanzate rispetto alla semplice modifica.
La maggior parte degli studi di comunicazione precedenti sui topi si sono concentrati sul lato dell'emettitore 35 , 36 . Alcuni studi hanno esplorato il lato del ricevitore 30 , 37 , 38 . I protocolli di riproduzione e discriminazione forniscono un semplice test per studiare il lato del ricevitore, come quello recentemente descritto da Asaba, Kato eal. 39 . In questo studio, gli autori hanno usato una scatola di prova a due scelte separata con schiuma acustica invece che la scatola di labirinti Y descritta qui. Entrambe le strutture di scelta hanno vantaggi e svantaggi. In primo luogo, il labirinto Y non isola il suono da un braccio all'altro, ma la scatola a due scelte fa. Tuttavia, usando il design del labirinto Y, l'animale può valutare rapidamente le due canzoni che vengono riprodotte contemporaneamente e si spostano verso quella preferita. Tuttavia, esperimenti di riproduzione in generale aiutano i sperimentatori a determinare il significato e quindi le funzioni delle vocalizzazioni generate per gli animali conspecifiche. In conclusione, dopo aver masterizzato le tecniche di questo protocollo e le analisi, i lettori devono essere in grado di affrontare molte domande che influenzano il contesto, la genetica e la neurobiologia degli USV del mouse.
Utilizzando i topi B6D2F1 / J, gli stimoli femminili associati quasi sempre innescano USV dai maschi che abbiamo testato nel nostro laboratorio. E 'fondamentale per il colleCt abbastanza sillabe (> 100 in 5 min) per essere in grado di ottenere una forte analisi statistica. Per la risoluzione dei problemi, se non vengono registrati (o non sufficienti) USV, controllare la configurazione per assicurarsi che i suoni siano registrati. Eseguire un'ispezione dal vivo di ciò che sta accadendo nella gabbia durante la registrazione guardando il sonogram real-time sullo schermo del computer dopo l'introduzione dello stimolo. Altrimenti cerchi di riesporre il maschio a una femmina sessualmente matura / ricettiva durante la notte e poi custodirli da soli per diversi giorni o fino a una settimana prima di registrare di nuovo. Sulla base di osservazioni aneddotiche, scopriamo che alcuni maschi cantano molto in un giorno (per quasi tutti i 5 minuti), e non molto il giorno successivo, e poi ancora un altro giorno. Non sappiamo il motivo per cui si verifica tale variabilità di soggetto, ma supponiamo che sia probabilmente una motivazione o stagionale per i maschi e lo stato di estrusione per le urine femminili. Se non vengono registrati USV, cercare di registrare l'animale in più giorni per raccogliere questi effetti variabili. UnlIke in canti da canto, non abbiamo notato notevoli differenze nella quantità di canto basato sul tempo del giorno. Troviamo che i maschi non cantano molto (<100 sillabe in 5 minuti) prima che siano 7 settimane.
I metodi di rilevazione qui presentati possono estrarre migliaia di sillabe e tutti i parametri acustici in pochi minuti. Ma come qualsiasi metodo di rilevamento automatico, è molto sensibile al rumore di fondo. Utilizzando il software di rilevazione Mouse Song Analyzer con registrazioni rumorose (ad esempio da animali registrati con biancheria da letto) può richiedere la regolazione della "soglia" di rilevazione per consentire maggiore flessibilità. Tuttavia, questo aumenterà anche il numero di sillabe false positive e il rilevamento automatico potrebbe non riuscire. In tali circostanze è possibile utilizzare codifica manuale.
Come si è detto in precedenza, il numero, i repertori e la latenza delle vocalizzazioni sono ampiamente variabili a seconda del ceppo, quindi potrebbe essere necessario modificare i parametri (lunghezza di registrazione,Stimolo, rilevazione sillabazione automatica, ecc. ) Per alcuni ceppi per garantire registrazioni ottimali per analisi statistiche.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi Howard Hughes Medical Institute a EDJ. Ringraziamo Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI – Università Parigi sud XI – FRANCIA) per averci prestato l'hardware dell'altoparlante. Ringraziamo anche i membri del Jarvis Lab per il loro supporto, discussioni, correzioni e commenti su questo lavoro, in particolare Joshua Jones Macopson per aiuto con figure e prove. Ringraziamo il dottor Gustavo Arriaga per aiuto con il software Mouse Song Analyzer, aggiornandolo per V1.3 e altri aspetti di questo protocollo. V1.0 del software è stato sviluppato da Holy e Guo, e v1.1 e v1.3 da Arriaga.
Materials
| Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
| Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
| Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
| Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
| Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
| Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
| plexiglas separation | home made | – | 4 x 13 cm plexiglas with 1cm holes |
| Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
| Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
| Y-maze | Home made | – | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
| Tweezers | |||
| Software | |||
| Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | – | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
| Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_v1.3-2015-03-23.zip | |
| Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
| Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
| Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis – in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
| Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http:// www.graphviz.org; | |
| Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
| Reagents | |||
| Xylazine (20mg/ml) | Anased | – | |
| Ketamine HCL (100mg/ml) | Henry Schein | #045822 | |
| distilled water | |||
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
| Cotton tips | |||
| Petri dish |
References
- Amato, F. R., Scalera, E., Sarli, C., Moles, A. Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups. Behav. Genet. 35, 103-112 (2005).
- Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PloS ONE. 2, e351 (2007).
- Moles, A., Costantini, F., Garbugino, L., Zanettini, C., D’Amato, F. R. Ultrasonic vocalizations emitted during dyadic interactions in female mice: a possible index of sociability. Behav. Brain Res. 182, 223-230 (2007).
- Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PloS ONE. 7, e29401 (2012).
- Yang, M., Loureiro, D., Kalikhman, D., Crawley, J. N. Male mice emit distinct ultrasonic vocalizations when the female leaves the social interaction arena. Front. Behav. Neurosci. 7, (2013).
- Petric, R., Kalcounis-Rueppell, M. C. Female and male adult brush mice (Peromyscus boylii) use ultrasonic vocalizations in the wild. Behaviour. 150, 1747-1766 (2013).
- Bishop, S. L., Lahvis, G. P. The autism diagnosis in translation: shared affect in children and mouse models of ASD. Autism Res. 4, 317-335 (2011).
- Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain & Behav. 10, 4-16 (2011).
- Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PloS ONE. 3, (2008).
- Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PloS ONE. 7, (2012).
- Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
- Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Science: JAALAS. 46, 28-28 (2007).
- Wohr, M., Schwarting, R. K. Affective communication in rodents: ultrasonic vocalizations as a tool for research on emotion and motivation. Cell Tissue Res. , 81-97 (2013).
- Pasch, B., George, A. S., Campbell, P., Phelps, S. M. Androgen-dependent male vocal performance influences female preference in Neotropical singing mice. Animal Behav. 82, 177-183 (2011).
- Asaba, A., Hattori, T., Mogi, K., Kikusui, T. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice. Front. Neurosci. 8, (2014).
- Balaban, E. Bird song syntax: learned intraspecific variation is meaningful. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3657-3660 (1988).
- Byers, B. E., Kroodsma, D. E. Female mate choice and songbird song repertoires. Animal Behav. 77, 13-22 (2009).
- Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PloS ONE. 7, (2012).
- Pomerantz, S. M., Nunez, A. A., Bean, N. J. Female behavior is affected by male ultrasonic vocalizations in house mice. Physiol. & Behav. 31, 91-96 (1983).
- White, N. R., Prasad, M., Barfield, R. J., Nyby, J. G. 40- and 70-kHz Vocalizations of Mice (Mus musculus) during Copulation. Physiol. & Behav. 63, 467-473 (1998).
- Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic ‘songs’ with approach behaviour. Biology Letters. 5, 589-592 (2009).
- Ey, E., et al. The Autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
- Chabout, J., Sarkar, A., Dunson, D. B., Jarvis, E. D. Male mice song syntax depends on social contexts and influences female preferences. Front. Behav. Neurosci. 9. 76, (2015).
- Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. & Behav. 96, 602-605 (2009).
- Roullet, F. I., Wohr, M., Crawley, J. N. Female urine-induced male mice ultrasonic vocalizations, but not scent-marking, is modulated by social experience. Behav. Brain Res. 216, 19-28 (2011).
- Barthelemy, M., Gourbal, B. E., Gabrion, C., Petit, G. Influence of the female sexual cycle on BALB/c mouse calling behaviour during mating. Die Naturwissenschaften. 91, 135-138 (2004).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS ONE. 7, (2012).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. ULTRASONIC EMISSIONS: DO THEY FACILITATE COURTSHIP OF MICE. J. Comp. Physiolog. Psych. 84, 445-452 (1973).
- Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in mice. PloS ONE. 9, 87186 (2014).
- Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
- Burkett, Z. D., Day, N. F., Penagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Scientific Reports. 5, 10237 (2015).
- Grimsley, J. M., Gadziola, M. A., Wenstrup, J. J. Automated classification of mouse pup isolation syllables: from cluster analysis to an Excel-based “mouse pup syllable classification calculator”. Front. Behav. Neurosci. 6, (2012).
- Grimsley, J. M. S., Monaghan, J. J. M., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PloS ONE. 6, (2011).
- Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Curr. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
- Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PloS ONE. 9, 97244 (2014).
- Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PloS ONE. 9, 85405 (2014).
- Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401 (2014).
- Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback. J Vis Exp. , (2015).
