Site-Directed Spin Labeling und EPR-spektroskopischen Untersuchungen von pentamerem liganden-gesteuerten Ionenkanäle

durch Scharen von hochaufgelösten Strukturen von mehreren Mitgliedern der Familie im Laufe der letzten zehn Jahre, das strukturelle Verständnis von pentamerem ligandengesteuerten Ionenkanäle (pLGIC) hat sprunghaft gewachsen. Wichtige Faktoren, die zu den aktuellen Entwicklungen auf dem Gebiet geführt sind, die Entdeckung von prokaryotischen pLGIC Kanäle, ^1-3 großen Fortschritte in der Expression eukaryotischen Membranprotein, ^4-6 und enorme Durchbrüche in der Strukturbestimmung Ansätze. ⁷ Diese Strukturen auf einen klaren Konsens schaffen die Gesamt Erhaltung der dreidimensionalen Architektur pLGIC. Allerdings sind zwei wichtige Bereiche, die sich hinter nachlaufen scheinen, sind die funktionelle Charakterisierung dieser Kanal Vorbereitungen und die mechanistische Beschreibung der Kanalfunktion.

Gating Konformationsänderungen sind komplex und treten über eine 60 Å Abstand entlang der Länge des Kanals und diese Übergänge werden in großem Umfang moduliert durchMembranlipiden. Insbesondere negativen Lipiden, Cholesterin und Phospholipide wurden , um die Funktion der pLGIC ^8-11 zu modulieren gezeigt. Während die genaue Rolle dieser Lipidbestand in Kanalfunktion unbekannt bleibt, würde eine vollständige molekulare Verständnis der Gating diese Kanäle in ihrer natürlichen Umgebung zu studieren. Site-ESR-Spektroskopie (SDSL) und Elektronenspinresonanz (EPR) -Spektroskopie sind die Techniken der Wahl für die Proteindynamik in rekonstituierten Systemen zu studieren. EPR-Spektroskopie wird durch die Molekülgröße (wie NMR) oder die optische Eigenschaft der Probe (wie Fluoreszenzspektroskopie) und dadurch ermöglicht Messungen von Volllängen-Konstrukten rekonstituiert in nativen Lipid Bedingungen beschränkt. Die Technik ist extrem empfindlich und relativ geringen Probenanforderungen (im pico-Mol-Bereich). Beide Aspekte machen die Technik gut geeignet für die Untersuchung großer Membranproteine, die schwer über Milligramm auszudrücken inMengen.

Die Verwendung von EPR – Spektroskopie in Kombination mit ortsgerichtete Spinmarkierung wurde von Wayne Hubbell und Kollegen entwickelt und wurde für die Untersuchung einer Reihe von Proteinarten angepasst. ^12-24 EPR – Daten verwendet wurden , Sekundärstrukturen, Veränderungen in dem Protein zu untersuchen , Konformation, membran Einstecktiefen und Protein-Protein / Protein-Ligand-Wechselwirkungen.

Das Verfahren beinhaltet das an den Positionen von Interesse durch ortsgerichtete Mutagenese Cystein-Substitution. Um die ortsspezifische Markierung zu gewährleisten, ist es notwendig , nativen Cysteinen mit einer anderen Aminosäure zu ersetzen (z. B. Serin) ein Cystein-weniger Vorlage zu erstellen. Bei weitem ist die beliebteste Spin-Label eine Thiol-spezifische MTSL: (1-oxyl-2,2,5,5-Tetramethyl-Δ3-pyrrolin-3-methyl) Methanthiosulfonat, die durch eine Disulfidbrücke Brücke an das Protein misst. Aufgrund seiner hohen Spezifität, relativ geringe Größe (etwas größer als Tryptophan) und flexikeit des Linkers Region hat sich diese Spin-Label mit einer vergrabenen Cystein sogar ausgezeichnete Reaktivität haben gezeigt worden. Weiterhin Reaktivität zu maximieren, die Markierungsreaktion des Proteins in Detergens-solubilisierten Form. Nach der Abtrennung des überschüssigen Chromatographie Gratis-Spin-Label durch Größenausschluss wird das Protein in Liposomen oder Doppelschicht-ähnlichen Systeme von definierten Lipidzusammensetzung rekonstituiert. Im allgemeinen wird Cystein Mutagenese auch in den meisten Teilen des Proteins toleriert, und die verhältnismäßig geringe Größe der Spin-Sonde verursacht minimale Störung der Sekundär- und Tertiärstrukturen. Um sicherzustellen, dass die Modifikation Wildtyp Funktionen beibehalten, die markierten und rekonstituiert Kanäle können durch Patch-Clamp-Messungen untersucht werden.

Das markierte funktionellen Protein wird dann zu spektroskopischen Messungen unterzogen, die drei Arten von Informationen im Wesentlichen liefern: ^{12,14,15,20,22,23,25-27} Spinsondendynamik durch lineshAffe Analyse; Zugänglichkeit der Sonde an paramagnetischem Entspannungsmittel; und Abstandsverteilung. ²⁷ EPR Abstände werden durch zwei verschiedene Methoden gemessen. Die erste basiert auf dem Continuous Wave (CW) Technik, bei der spektrale Verbreiterung von dipolaren Wechselwirkungen zwischen Spin-Labels (in der von 8 – 20 Å Entfernungsbereich) entstehen. Verwendet wird Entfernung zu bestimmen ^28,29 Die zweite ist eine gepulste EPR Verfahren , bei dem Abstandsmessungen bis 70 Å verlängert werden kann. ^30-34 im Doppel Electron Electron Resonanz (DEER), Schwingungen in der Spin-Echo – Amplitude analysiert Abstände und Abstandsverteilungen zu bestimmen. Hier wird das Spin-Echo bei der Frequenz der dipolaren Wechselwirkung moduliert. Gemeinsam werden diese Parameter verwendet, um Protein-Topologie, Sekundärstrukturelemente und Protein-Konformationsänderungen zu bestimmen.